Qiagen، P7670L، 2x HiFi PCR Master Mix (24 تفاعلًا)

لـ 24 تفاعلًا: 2x HiFi PCR Master Mix (1 x 0.6 مل) و HiFi Enhancer (1 x 0.25 مل)

سمات

- حساسية عالية وكفاءة تضخيم محسّنة في تطبيقات التسلسل الجيني من الجيل التالي
- يُظهر تحيزًا ضئيلًا في تضخيم مكتبة الحمض النووي
- تغطية جينومية ممتازة حتى في المناطق ذات المحتوى العالي للغاية من GC

تفاصيل المنتج

مزيج 2x HiFi PCR Master Mix هو مزيج رئيسي عالي الكفاءة وعالي الدقة ومنخفض التحيز لتضخيم مكتبة NGS.

يتم توفير 2x HiFi PCR Master Mix مع HiFi Enhancer (رقم الكتالوج M0313L).

أداء

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية

خصائص الخلطة

مبدأ

مزيج التفاعل الرئيسي HiFi PCR 2x (P7670L) هو محلول جاهز للاستخدام يحتوي على جميع المكونات اللازمة لتضخيم مكتبات التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS)، بما في ذلك بوليميراز الحمض النووي HiFi ذو بدء التشغيل الساخن في محلول منظم مُحسَّن لضمان كفاءة عالية ودقة عالية وتحيز منخفض في التضخيم. عادةً ما تتطلب مكتبات NGS المُحضَّرة بكمية محدودة من المادة الأولية تضخيم PCR لتوليد قوالب كافية لتحديد كمية المكتبة وتسلسلها. تُظهر المكتبات المُضخَّمة باستخدام مزيج التفاعل الرئيسي HiFi PCR 2x تحيزًا ضئيلاً، ومعدل خطأ منخفضًا، وتغطية جينومية ممتازة حتى في المناطق ذات المحتوى المنخفض أو المرتفع للغاية من GC. تُساعد هذه الميزات على تقليل تحيز التسلسل، وخفض معدل التكرار، وتحسين جودة البيانات وتجانس التغطية.

إجراء

الخطوة: درجة الحرارة
درجة حرارة التمسخ الأولية: 98 درجة مئوية
التمسخ: 98 درجة مئوية
التلدين: 60 درجة مئوية *
التمديد: 72 درجة مئوية
التمديد النهائي: 72 درجة مئوية
درجة حرارة التخزين: 4 درجات مئوية

المكونات: حجم التفاعل الواحد (ميكرولتر)
قالب الحمض النووي: X
مزيج رئيسي عالي الدقة PCR 2X: 25
مزيج التمهيد: نعم
ماء خالٍ من النيوكلياز: 25–X–Y
المجموع: 50

الخطوة: درجة الحرارة
درجة حرارة التمسخ الأولية: 98 درجة مئوية
التمسخ: 98 درجة مئوية
التلدين: 60 درجة مئوية
التمديد: 72 درجة مئوية
التمديد النهائي: 72 درجة مئوية
درجة حرارة التخزين: 4 درجات مئوية

المكونات: حجم التفاعل الواحد (ميكرولتر)
خرزات تحتوي على قالب الحمض النووي الملتقط: X
مزيج رئيسي عالي الدقة PCR عدد 2: 25
مزيج برايمر*: نعم
مُحسِّن الصوت عالي الدقة†: 2
ماء خالٍ من النيوكلياز: 23-XY
الحجم الإجمالي: 50

رقم الصنف: الوصف
Y9410L: مزيج تجزئة WGS 5X
Y9420L: مزيج إنزيمات ER/A-Tailing 5X
L6030-WL: إنزيم ربط الحمض النووي T4 (NGS)

- برمج جهاز التدوير الحراري بالمعايير الموضحة في الجدول أدناه. اضبط غطاء التسخين للجهاز على 105 درجة مئوية. عندما تصل درجة حرارة كتلة جهاز التدوير الحراري إلى 98 درجة مئوية، أوقف البرنامج مؤقتًا. الخطوة درجة الحرارة وقت الحضانة رقم الدورة التفكك الأولي 98 درجة مئوية 45 ثانية 1 التفكك 98 درجة مئوية 15 ثانية حسب الحاجة* التلدين 60 درجة مئوية 30 ثانية الاستطالة 72 درجة مئوية 30 ثانية الاستطالة النهائية 72 درجة مئوية دقيقة واحدة 1 التثبيت 4 درجات مئوية ∞ غير متوفر * يجب تحسين عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وفقًا لإرشادات مورد مسبار الالتقاط
- حضّر مزيج تفاعل التضخيم بعد الالتقاط في أنبوب منفصل وفقًا للجدول أدناه. المكونات حجم التفاعل الواحد (ميكرولتر) خرزات مع قالب الحمض النووي الملتقط X 2x مزيج HiFi PCR الرئيسي 25 مزيج البادئات* Y مُحسِّن HiFi† 2 ماء خالٍ من النيوكلياز 23-XY الحجم الكلي 50 * تركيز نهائي قدره 0.5 ميكرومول لكل بادئ للتضخيم على الخرزة. يُرجى اتباع تعليمات الشركة المصنعة/المورد. † يجب إضافة 2-2.5 ميكرولتر من مُحسِّن HiFi إلى كل تفاعل لضمان كفاءة عالية للتضخيم على الخرزة. عند استخدام حجم أكبر من الخرز، قم بتعديل كمية مُحسِّن HiFi وفقًا لذلك.
- استخدم الماصة لرفع وخفض المكونات لضمان مزجها. قم بتدويرها برفق مع التأكد من بقاء الخرز في المحلول.
- انقل أنبوب التفاعل إلى جهاز التدوير الحراري المسخن مسبقًا (98 درجة مئوية). استأنف برنامج التدوير.
- عند اكتمال برنامج التدوير الحراري وعودة كتلة العينة إلى 4 درجات مئوية، قم بإزالة العينة من الكتلة وانتقل فورًا إلى عملية التنظيف بعد التضخيم باستخدام خرز QIAseq أو أي طريقة تنقية أخرى مطلوبة.
- التحقق من صحة المكتبة وتحديد كميتها باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي، و qPCR و/أو Bioanalyzer.

1. برمج جهاز التدوير الحراري بالمعايير المذكورة في الجدول أدناه. اضبط غطاء التسخين الخاص بالجهاز على 105 درجة مئوية. عندما تصل درجة حرارة كتلة جهاز التدوير الحراري إلى 98 درجة مئوية، أوقف البرنامج مؤقتًا.

* قد يكون من الضروري تحسين درجة حرارة التلدين.

† يجب تعديل عدد دورات التضخيم بناءً على تركيز قالب الحمض النووي، وتركيزات البادئات، وإنتاج مكتبة الحمض النووي الكافي للتطبيقات اللاحقة.

‡ يوصى بـ 30-60 ثانية/كيلوبايت عند تحديد وقت التمديد.

٢. حضّر تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في أنبوب جديد على الجليد بمزج قالب الحمض النووي، ومزيج HiFi PCR Master Mix بتركيز 2X، والبادئات المُقدمة من العميل، كما هو موضح في الجدول أدناه. امزج جيدًا عن طريق سحب المحلول ودفعه بالماصة ٨-١٠ مرات. يمكن تعديل الأحجام حسب الحاجة.

3. قم بتدوير أنبوب العينة بشكل نبضي وانقله فوراً إلى جهاز التدوير الحراري المسخن مسبقاً (98 درجة مئوية). استأنف برنامج التدوير.

4. عند اكتمال برنامج التدوير الحراري وعودة كتلة العينة إلى 4 درجات مئوية، قم بإزالة العينة من الكتلة وانتقل فورًا إلى التنظيف بعد التضخيم باستخدام خرز AMPureXP أو طريقة التنقية الأخرى المطلوبة.

5. التحقق من صحة المكتبة وتحديد كميتها باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي، و qPCR و/أو Bioanalyzer.

إثراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد الالتقاط

يتوافق مزيج التفاعل الرئيسي HiFi PCR 2x مع إجراءات إثراء الأهداف، مثل تلك التي تستخدم مجسات وألواح التقاط التهجين القائمة على الخرز. تم التحقق من صحة التعليمات التالية لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للأهداف المُثرية باستخدام مجسات وكواشف xGen Lockdown من IDT. في هذا الإجراء، يتم تثبيت الأهداف المراد تضخيمها على خرز Dynabeads M-270 Streptavidin. في حال استخدام أنواع أخرى من خرز الالتقاط، قد يلزم تحسين التفاعل وفقًا لذلك.

تحليل مراقبة الجودة

يُختبر مزيج HiFi PCR Master Mix وظيفيًا عن طريق تضخيم مكتبة DNA مُحضّرة من DNA جينومي بكتيري مختلط بنسبة GC تتراوح بين 10 و80%. يجب ألا تتجاوز الاختلافات في كمية المكتبة وخصائصها بين الدفعات المختلفة 15%. يجب أن يُنتج تسلسل المكتبة المُضخّمة قراءات مُطابقة بنسبة تزيد عن 90% وتغطية مُعيّرة تتراوح بين 0.7 و1.3 عبر نطاق GC الكامل.

التطبيقات

- تضخيم مكتبة NGS

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: