شركة كياجين، P7720L، إنزيم النسخ العكسي ستابل سكريبت (250 وحدة)

250 وحدة من إنزيم النسخ العكسي StableScript (0.05 مل عند 5000 وحدة/مل) و4x محلول التفاعل StableScript (1 × 1.5 مل)

سمات

- إنزيم النسخ العكسي متعدد الاستخدامات مناسب لتقنية RT-PCR وتقنية RT-qPCR بخطوة واحدة
- يُوصى به لتقنية RT-PCR طويلة المدى
- كشف الحمض النووي الريبي عالي الحساسية
- تحسين الثبات الحراري، وكفاءة المعالجة، ومقاومة المثبطات

تفاصيل المنتج

إنزيم النسخ العكسي StableScript متعدد الاستخدامات، مصمم خصيصًا للاستخدام في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في خطوة واحدة (RT-qPCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى (RT-PCR). يتميز هذا الإنزيم بانعدام نشاط إنزيم RNase H القابل للكشف، كما يتمتع بثبات حراري عالٍ، حيث يعمل بكفاءة في نطاق درجة حرارة يتراوح بين 45 و65 درجة مئوية. يساعد ذلك في التغلب على صعوبات الكشف عن أهداف الحمض النووي الريبوزي (RNA) المعقدة، ويتيح الحصول على كميات كبيرة من الحمض النووي التكميلي (cDNA). يُظهر إنزيم النسخ العكسي StableScript أداءً موثوقًا به حتى في وجود مثبطات شائعة.

يتم تعريف وحدة واحدة من StableScript Reverse Transcriptase على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لدمج 1 نانومول من dTTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية باستخدام poly r(A)/oligo(dT) كركيزة.

يتم توفير الإنزيم في 20 ملي مولار KPO4، 1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، مثبت، 50% جلسرين؛ درجة الحموضة 7.0 عند 25 درجة مئوية.

يتم تزويد الإنزيم بمحلول تفاعل StableScript بتركيز 4X.

أداء

الاختبار: المواصفات
النقاء: >99%
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 5000 وحدة <5% مُحرر
إنزيم إكسونوكلياز ثنائي السلسلة: 5000 وحدة <1% مُحرر
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 5000 وحدة = لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 5000 وحدة <10 نسخ
تلوث بإنزيم RNase: 5000 وحدة؛ لا يوجد إنزيم RNase غير محدد قابل للكشف
اختبار RT-PCR الوظيفي: تضخيم دفعة الاختبار ضمن قيمة Ct واحدة من دفعة المرجع في اختبار RT-qPCR أحادي الخطوة

- درجة حرارة التمديد المثلى: 55 درجة مئوية
- طول النص: يصل إلى 12.3 كيلوبايت

خصائص البوليميراز

مبدأ

إنزيم النسخ العكسي (RT)، المعروف أيضًا باسم بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي، هو إنزيم بوليميراز الحمض النووي الذي ينسخ الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة إلى حمض نووي. تستخدم الفيروسات، مثل فيروس نقص المناعة البشرية وفيروس التهاب الكبد ب، إنزيمات النسخ العكسي لتضاعف جينوماتها، كما تستخدمها العناصر المتحركة الرجعية للتكاثر داخل جينوم العائل.

تُستخدم إنزيمات النسخ العكسي في البيولوجيا الجزيئية للكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) ومعالجتها من خلال التضخيم. تقوم هذه الإنزيمات ببلمرة سلسلة من الحمض النووي (cDNA) تُكمل قالب الحمض النووي الريبوزي الأصلي. بعد ذلك، يمكن تضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA) بشكل أكبر باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لتحليل النسخ والتعبير الجيني.

يُؤدي نشاط إنزيم RNase H إلى تحلل شريط الحمض النووي الريبوزي (RNA) في هجين الحمض النووي (DNA/RNA)، مما يُحرر شريط الحمض النووي (DNA) المُصنّع حديثًا لاستخدامه كقالب في تخليق الشريط الثاني من الحمض النووي (DNA). يُعتبر نشاط إنزيم RNase H غير مُفيد لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) الطويل، نظرًا لقدرة الإنزيم على تحلل قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) قبل اكتمال عملية النسخ العكسي الكاملة.

لا يمتلك إنزيم النسخ العكسي StableScript أي نشاط ملحوظ لإنزيم RNase H، ويتميز بثبات حراري عالٍ. كما يُظهر هذا الإنزيم حساسية عالية في الكشف عن الحمض النووي الريبي، وقدرة معالجة محسّنة، ومقاومة مُعززة للمثبطات.

إجراء

تتوفر تعليمات استخدام إنزيم النسخ العكسي StableScript في بروتوكول المجموعة المقابل في الموارد أدناه.

ضبط الجودة

تم قياس نشاط وحدة إنزيم النسخ العكسي StableScript باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في مخفف StableScript 1X وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على 20 ميكروغرام/مل من الحمض النووي الريبوزي متعدد الأدينين (poly r(A))، وحمض نووي أوليغو (dT)، ومحلول تفاعل StableScript 1X، و3H-dTTP، و250 ميكرومول من dTTP، وتم تحليلها باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، الإصدار 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

تم تحديد تركيز البروتين لـ StableScript Reverse Transcriptase (OD 280) عن طريق امتصاص OD 280.

تم تقييم النقاء الفيزيائي لإنزيم النسخ العكسي StableScript باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. وقد تم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية للأشرطة الملوثة في العينة المركزة بكتلة شريط البروتين المطلوب في العينة المخففة.

تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في StableScript Reverse Transcriptase في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في StableScript Reverse Transcriptase في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في إنزيم النسخ العكسي StableScript في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم وتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تقييم تلوث E. coli لـ StableScript Reverse Transcriptase باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لـ E. coli باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

تم تقييم التلوث غير المحدد لـ RNase في StableScript Reverse Transcriptase باستخدام مجموعة الكشف عن النيوكلياز وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة.

تم تقييم فعالية اختبار RT-PCR من خلال تضخيم ثلاثة نسخ mRNA في اختبار RT-qPCR أحادي الخطوة. وقد قورنت عتبة التضخيم (Ct) للدفعة المختبرة بدفعة مرجعية.

التطبيقات

- RT-qPCR
- تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)
- تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي طويل المدى
- تقنية التسلسل من الجيل التالي

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: