شركة كياجين، RT35-020، مثبط إنزيم RNase Hu (2000 وحدة)

درجة حرارة التخزين: -20 درجة مئوية بدون دورة إزالة الجليد

سمات

- يثبط تمامًا نشاط إنزيمات RNase A و RNase B و RNase C
- لا يؤثر على أي نشاط للبوليميراز أو النسخ العكسي
- يحافظ على استقراره الكامل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع على الأقل دون فقدان فعاليته
- نشط في ظروف تفاعل متنوعة وفي محاليل منظمة مختلفة
- خالٍ من نشاط إنزيمات DNase و RNase

تفاصيل المنتج

إن مثبط RNase Hu هو بروتين مشيمي بشري معاد تركيبه مقاوم للحرارة، يبلغ وزنه 50 كيلو دالتون، ويتم التعبير عنه في الإشريكية القولونية، وهو يثبط نشاط RNase للإنزيمات حقيقية النواة الشائعة مثل RNase A و RNase B و RNase C.

يحتوي على 20 ملي مولار من هيبس-بوتاسيوم هيدروكسيد (الأس الهيدروجيني 7.6)، و50 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم، و8 ملي مولار من عامل الاختزال، و50% (حجم/حجم) من الجلسرين. وهو مستقر حتى درجة حرارة 58 درجة مئوية، وبتركيز لا يقل عن 0.5-1 ملي مولار من ثنائي ثيوثريتول.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لتثبيط نشاط 5 نانوغرام من RNase A بنسبة 50٪.

أداء

الفحص: المواصفات
النقاء: >90%
لم يتم الكشف عن أي تلوث بإنزيم RNase.
التلوث الكامن بالريبونوكلياز: لم يتم الكشف عن أي تلوث
التلوث بالإكسونوكلياز: لم يتم الكشف عن أي تلوث.
التلوث بالإنزيمات الداخلية: لم يتم الكشف عن أي تلوث.

مبدأ

يثبط مثبط إنزيم الريبونوكلياز Hu إنزيمات الريبونوكلياز عن طريق الارتباط غير التساهمي بنسبة 1:1 مع تفاعل بروتين-بروتين عالي الألفة، مكونًا أحد أقوى المركبات الجزيئية الحيوية المعروفة. يساعد هذا النشاط بفعالية في الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) وفي الحصول على الكمية والجودة المناسبتين منه.

يُستخدم هذا الإنزيم في التطبيقات التي يُشكل فيها وجود إنزيمات الريبونوكلياز خطرًا كبيرًا على الحصول على بيانات عالية الجودة وموثوقة وقابلة للتكرار، مثل عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA)، وتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، والنسخ والترجمة في المختبر، أو تحضير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخالية من إنزيمات الريبونوكلياز [1-6]. وهو متوافق مع العديد من الكواشف، بما في ذلك بوليميرازات الحمض النووي (DNA) وإنزيم النسخ العكسي AMV أو M-MuLV، ولا تؤثر إضافته إلى التفاعل على كفاءة المكونات الأخرى.

إجراء

يعتمد التركيز النهائي الأمثل لمثبط إنزيم الريبونيوكلياز Hu في التفاعل على مستوى تلوث إنزيم الريبونيوكلياز، ومدة الحضانة، والمركبات الموجودة في مزيج التفاعل. ويتراوح هذا التركيز بين 1 و2 وحدة/ميكرولتر.
- بالنسبة لتفاعل النسخ العكسي القياسي، استخدم 1 ميكرولتر (40 وحدة) من مثبط RNase Hu للحصول على حجم عينة نهائي قدره 20 ميكرولتر.
- يُعد تركيز DTT النهائي الذي يتراوح بين 0.5 و 1 ملي مول ضروريًا للنشاط الأمثل.
- أثناء عملية تجميع التفاعل، يجب إضافة الإنزيم قبل المكونات الأخرى التي قد تكون مصادر محتملة لتلوث RNase.
- إن استخدام مثبط RNase Hu لا يستبعد معالجة RNase H بعد تضخيم cDNA السلسلة الأولى.

ضبط الجودة

يتم تحديد نقاء البروتين باستخدام فحص بواسطة الرحلان الكهربائي SDS-PAGE مما ينتج عنه نقاء >90%.

يتم تقييم التلوث بإنزيم RNase عن طريق قياس نشاط هذا الإنزيم من خلال حضانة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مع 200 وحدة على الأقل من مثبط إنزيم RNase لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. وتُعرض النتائج على هلام الأغاروز المصبوغ ببروميد الإيثيديوم.

يتم تقييم التلوث الكامن بالريبونوكلياز عن طريق قياس نشاط الريبونوكلياز الكامن من خلال حضانة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مع 200 وحدة على الأقل من مثبط الريبونوكلياز المعطل حرارياً لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. وتُعرض النتائج على هلام الأغاروز المصبوغ ببروميد الإيثيديوم.

يُحدد نشاط الإندونوكلياز بحضانة 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي فائق الالتفاف مع 200 وحدة على الأقل من مثبط إنزيم الريبونوكلياز لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. تُعرض النتائج على هلام أجاروز مُلوّن ببروميد الإيثيديوم. يُحدد نشاط الإكسونوكلياز بحضانة 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي المُهضّم مع 200 وحدة على الأقل من مثبط إنزيم الريبونوكلياز الجاهز للتجميد لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. تُعرض النتائج على هلام أجاروز مُلوّن ببروميد الإيثيديوم.

الاستخدام

التطبيقات

- التشخيص الجزيئي المتعلق بالحمض النووي الريبي
- عزل وتنقية الحمض النووي الريبي (RNA)
- تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)، تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR)
- النسخ والترجمة في المختبر
- تحضير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخالية من إنزيم RNase

يُستخدم هذا في التطبيقات للتغلب على التحديات في تثبيط وجود إنزيمات الريبونيوكلياز المنتشرة في كل مكان، والتي توجد عادة في الجلد والغبار والكواشف والعينات البيولوجية، مثل: