كياجين، X8010L، إكسونوكلياز I (30000 وحدة)

30000 وحدة من إكسونوكلياز I (1.5 مل عند 20000 وحدة/مل)

سمات

- يقوم باستئصال القواعد من الحمض النووي أحادي السلسلة في الاتجاه 3ʹ→ 5ʹ
- يزيل الحمض النووي أحادي السلسلة الخطي، تاركاً وراءه الحمض النووي ثنائي السلسلة في العينة

تفاصيل المنتج

يقوم إنزيم إكسونوكلياز I بقطع الحمض النووي أحادي السلسلة في الاتجاه 3ʹ→5ʹ، مُحررًا نيوكليوتيدات أحادية/ثنائية عند الطرف 5ʹ، تاركًا جزيئات الحمض النووي ثنائية السلسلة والطرف 5ʹ سليمة. يتميز هذا الإنزيم بقدرته على التتابع، على الرغم من أن عملية الهضم تُثبط بوجود مجموعة فوسفات طرفية عند الطرف 3ʹ. يتحمل إنزيم إكسونوكلياز I نطاقًا واسعًا من ظروف المحاليل المنظمة، ويمكن إضافته عادةً إلى التفاعلات التي تحتوي على المغنيسيوم (1-3).

يتم توفير هذا الإنزيم في 10 ملي مولار من Tris-HCl، و100 ملي مولار من NaCl، و1 ملي مولار من DTT، و0.5 ملي مولار من EDTA، و50% من الجلسرين: درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: الوحدات المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 200 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 200 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 54500 دالتون

مبدأ

يتم إنتاج البروتين بواسطة سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية التي تعبر عن جين الإكسونوكلياز الأول المؤتلف.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لإنتاج 10 نانومول من النيوكليوتيد الكلي القابل للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

إجراء

- قم بإعداد خليط التفاعل التالي بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر: 5 ميكرولتر من ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل 10 وحدات من إكسونوكلياز I (X8010L)
- 5 ميكرولتر من ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل
- 10 وحدات من إكسونوكلياز I (X8010L)
- قم بحضانة خليط التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- قم بتعطيل الإنزيم بالحرارة عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

- 5 ميكرولتر من ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل
- 10 وحدات من إكسونوكلياز I (X8010L)

- يقوم إنزيم الإكسونوكلياز الأول بتحليل بادئات الأوليغونوكليوتيد أحادية السلسلة بشكل تفضيلي في تفاعل يحتوي على منتجات التضخيم أو مصادر أخرى للحمض النووي ثنائي السلسلة، تاركًا الجزيئات ثنائية السلسلة سليمة.
- إنزيم إكسونوكلياز الأول، بالاشتراك مع إنزيم لامدا إكسونوكلياز (X8030L)، يزيل بشكل فعال أنواع الحمض النووي الخطي من مستحضرات البلازميد.
- يعمل إنزيم إكسونوكلياز الأول بشكل جيد في معظم محاليل البيولوجيا الجزيئية التي تحتوي على المغنيسيوم بتركيز يزيد عن 1.5 ملي مولار.

تعليمات الاستخدام

إزالة الحمض النووي أحادي السلسلة من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)

ملحوظات:

مراجع:

1. ليمان، آي آر ونوسباوم، إيه إل (1964) مجلة الكيمياء البيولوجية، 239، 2628. 2. كوشنر، إس آر وآخرون (1971) وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية، 68، 824. 3. كوشنر، إس آر وآخرون (1972) وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية، 69، 1366.

ضبط الجودة

تم قياس النشاط الوحدوي باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي المزدوج.

تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول تخزين إكسونوكلياز I يحتوي على الجلسرين (50%)، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على قطعة DNA أحادية السلسلة موسومة بالتريتيوم و67 ملي مولار من جليسين-KOH (الأس الهيدروجيني 9.5)، و10 ملي مولار من DTT، و6.7 ملي مولار من MgCl2. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة الترسيب بحمض ثلاثي كلورو الأسيتيك.

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- تنظيف تحضير البلازميد
- يزيل الحمض النووي أحادي السلسلة من خليط من الحمض النووي أحادي السلسلة الخطي والحمض النووي ثنائي السلسلة
- يزيل بادئات الأوليغونوكليوتيدات بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: