كياجين، X8020L، إكسونوكلياز III

50,000 وحدة من إكسونوكلياز III (100,000 وحدة/مل) (0.5 مل) و10X محلول أصفر منظم (1 × 1.5 مل)

سمات

- يقوم الإكسونوكلياز باستئصال القواعد من الحمض النووي المزدوج في اتجاه 3'→5'
- إنزيم متعدد الوظائف ذو أنشطة فوسفاتاز، وإكسونوكلياز، وإندونوكلياز AP، وRNase H

تفاصيل المنتج

إنزيم إكسونوكلياز III هو إنزيم إكسونوكلياز يعمل باتجاه 3′→5′، حيث يقوم بهضم أحد خيوط الحمض النووي المزدوج (dsDNA) في كل مرة، أو هضم خيط الحمض النووي الريبوزي (RNA) في الحمض النووي الهجين (RNA-DNA). يزيل إكسونوكلياز III عددًا محدودًا من النيوكليوتيدات في كل عملية ارتباط، مما يؤدي إلى حذف تدريجي منسق ضمن مجموعة جزيئات الحمض النووي. يزيل إكسونوكلياز III المجموعات الطرفية 3′ على الحمض النووي المزدوج، ويحلل بكفاءة نهايات الحمض النووي المتراجعة 3′ دون النهايات البارزة 3′ (مكونًا نهايات 5′ بارزة)، ويكسر روابط الفوسفودايستر على الجانب 5′ من مواقع AP في كل من الحمض النووي المزدوج والمفرد، ويزيد من معدل دوران إنزيم غليكوزيلاز الحمض النووي MutY.

يتم توفير الإنزيم في 25 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين؛ درجة الحموضة 8.0 عند 25 درجة مئوية.

يتم تزويد الإنزيم بمحلول منظم أصفر 10X (B0130) يحتوي على 100 ملي مول من ثنائي بروبان هيدروكلوريد، 100 ملي مول من كلوريد المغنيسيوم، 10 ملي مول من ثنائي ثيوثريتول؛ درجة الحموضة 7.0 عند 25 درجة مئوية.

يمكن تعطيل الإكسونوكلياز 3'→5' عن طريق التسخين عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

أداء

الفحص: المواصفات
النقاء: >99%
النشاط النوعي: 100,000 وحدة/ملغ
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 1000 وحدة = لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 1000 وحدة <10 نسخ
نشاط إنزيم UDG: أقل من 20 وحدة/مل

مبدأ

تطورت معظم الإنزيمات الداخلية والخارجية كإنزيمات منفصلة، ​​لكن بعض الإنزيمات تطورت لتؤدي كلا النشاطين. إن إنزيم إكسونوكلياز III في بكتيريا الإشريكية القولونية هو إنزيم نوكلياز متعدد الوظائف، حيث يؤدي نشاط كل من الإندونوكلياز المحدد لموقع AP والإكسونوكلياز 3′→5′.

يُعد نشاط الإكسونيوكلياز III، الذي يعمل في الاتجاه 3'→5'، خاصًا بالحمض النووي المزدوج. يقوم الإكسونيوكلياز III بتحليل الحمض النووي المزدوج من النهايات غير المتداخلة، أو النهايات المتدلية 5'، أو الشقوق، ويُحرر النيوكليوتيدات الأحادية 5' من النهايات 3' لسلاسل الحمض النووي، مُنتجًا بذلك أجزاءً من الحمض النووي أحادي السلسلة. لا يكون هذا الإنزيم نشطًا على النهايات المتدلية 3' للحمض النووي التي يبلغ طولها أربع قواعد على الأقل، والتي لا تحمل بقايا سيتوزين 3' في الحمض النووي أحادي السلسلة. كما أنه غير نشط على النيوكليوتيدات المرتبطة بروابط فوسفوروثيواتية.

يقوم نشاط الإكسونوكلياز III RNase H بتحليل سلسلة الحمض النووي الريبي (RNA) في هجائن الحمض النووي الريبي-الحمض النووي (RNA-DNA) عن طريق التحلل الإكسونوكليازي. كما يقوم نشاط الفوسفاتاز 3' للإكسونوكلياز III بإزالة مجموعة الفوسفات الطرفية 3'، مما ينتج عنه مجموعة هيدروكسيل 3' (3'-OH).

إجراء

تتوفر تعليمات استخدام إنزيم إكسونوكلياز III في بروتوكول المجموعة المقابل في الموارد أدناه.

ضبط الجودة

تم قياس نشاط وحدة الإكسونوكلياز III باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول التفاعل 1X، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على قطعة DNA موسومة بالتريتيوم ومحلول Exo III الأصفر 1X. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة الترسيب بحمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA).

تم تحديد تركيز البروتين لـ Exonuclease III (OD 280) عن طريق امتصاص OD 280.

تم تقييم النقاء الفيزيائي لإنزيم إكسونوكلياز III باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. وقد تم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية للأشرطة الملوثة في العينة المركزة بكتلة شريط البروتين المطلوب في العينة المخففة.

تم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في إنزيم إكسونوكلياز III في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تقييم تلوث E. coli لـ Exonuclease III باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لـ E. coli باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

تم تقييم تلوث إنزيم إكسونوكلياز III بإنزيم يوراسيل دي إن إيه جليكوزيلاز (UDG) في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على حمض نووي يوراسيل مشع بالتريتيوم و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، وتم تحضينه لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف توصيف وحدة UDG القياسية.

التطبيقات

- تحليل تفاعل الحمض النووي مع البروتين بواسطة تقنية بصمة الحمض النووي Exo III
- إنتاج عمليات حذف متداخلة في الحمض النووي المزدوج السلسلة
- تجميع الحمض النووي القائم على التماثل الإنزيمي عبر SENAX (مزيج تجميع النيوكلياز الخارجي النجمي)
- استنساخ منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
- تحضير الحمض النووي أحادي السلسلة لتسلسل ثنائي الديوكسي
- الطفرات الموجهة للموقع
- تحضير مجسات خاصة بالسلسلة

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: