كياجين، Y9040L، كيناز عديد النوكليوتيد T4 (10000 وحدة)

10000 وحدة من كيناز عديد النوكليوتيد T4 (1.0 مل عند 10000 وحدة/مل) ومحلول منظم كيناز عديد النوكليوتيد 10X (2 × 1.5 مل)

سمات

- يدمج الفوسفات الموسومة في الطرف 5' من الأحماض النووية
- يحفز نقل وتبادل الفوسفات إلى مجموعة 5′-OH في الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) والحمض النووي الريبي (RNA).
- يحفز نقل وتبادل الفوسفات إلى مجموعة 5′-OH في الحمض النووي المزدوج السلسلة
- يزيل مجموعات الفوسفوريل 3′ من الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA أو النيوكليوتيد/النيوكليوسيد

تفاصيل المنتج

يُستخدم إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز (PNK) على نطاق واسع لفسفرة الطرف 5' لكل من الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA في تجارب الوسم والربط. يحفز إنزيم T4 PNK نقل وتبادل مجموعة الفوسفات الطرفية في الموقع غاما من جزيء ATP إلى الطرف 5'-هيدروكسيل لجزيئات الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA والنيوكليوزيد أحادي الفوسفات ثنائي السلسلة وأحادي السلسلة.

يحفز إنزيم T4 PNK أيضًا الإزالة التحللية لمجموعات الفوسفات الثلاثية (3′-PO4) من الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA وأحادي فوسفات الديوكسي نيوكليوزيد 3′. يُستخدم هذا الإنزيم لإزالة مجموعات الفوسفوريل الثلاثية من النيوكليوتيدات/النيوكليوزيدات أو الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA في دراسات التعبير الجيني ووظائف الجينات.

بالإضافة إلى أهميته في أبحاث البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية، فإن T4 PNK يمثل عائلة من الإنزيمات ثنائية الوظائف ذات أنشطة 5′-كيناز و3′-فوسفاتاز التي تلعب أدوارًا رئيسية في إصلاح الحمض النووي الريبي والحمض النووي.

يتم توفير الإنزيم في 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 0.1 ميكرومولار ATP، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين؛ درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية.

يتم تزويد الإنزيم بمحلول منظم PNK 10X (B9040) يحتوي على 700 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار MgCl2، 50 ملي مولار DTT؛ درجة الحموضة 7.6 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: المواصفات
النقاء: >99%
النشاط النوعي: 133,333 وحدة/ملغ
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 2000 وحدة <5.0% مُحرر
إنزيم إكسونوكلياز ثنائي السلسلة: 2000 وحدة <1.0% مُحرر
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 2000 وحدة = لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 2000 وحدة؛ أقل من 10 نسخ

مبدأ

يحفز إنزيم T4 بولينوكليوتيد كيناز (PNK) نقل وتبادل مجموعة الفوسفات الطرفية في الموقع غاما من جزيء ATP إلى الطرف الهيدروكسيلي 5′ لجزيئات الحمض النووي DNA، والحمض النووي RNA، والنيوكليوزيد أحادي الفوسفات 3′، سواء كانت مزدوجة أو أحادية السلسلة. كما يمتلك إنزيم T4 PNK نشاطًا كإنزيم فوسفاتاز 3′ وإنزيم فوسفودايستراز حلقي 2′، 3′.

إجراء

تتوفر تعليمات استخدام إنزيم T4 Polynucleotide Kinase في بروتوكول المجموعة المقابل في الموارد أدناه.

ضبط الجودة

تم قياس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول التفاعل 1X، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على 10 ميكرومول من الحمض النووي أحادي السلسلة Oligo(dT)، ومحلول تفاعل PNK 1X، و66 ميكرومول من ATP و[γ 32 P]-ATP. حُضنت التفاعلات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، الإصدار 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

تم تحديد تركيز البروتين عن طريق الامتصاص الضوئي عند 280. تم تحليل عينة من الإنزيم بحجم 2.0 ميكرولتر عند 280 باستخدام مطياف ضوئي تم معايرته باستخدام عينة BSA بتركيز 2.0 ملغم/مل وتمت تصفيتها باستخدام محلول تخزين المنتج.

تم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعًا بالكشف باستخدام صبغة الفضة. وقد تم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة حزمة البروتين المطلوب في العينة المخففة.

تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على 10000 عدّ في الدقيقة من الحمض النووي أحادي السلسلة الموسوم إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم. أدى التحضين لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية إلى إطلاق أقل من 5.0% من العدّات القابلة للذوبان في حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك.

تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلاسل في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على 5000 عدّ في الدقيقة من ركيزة الحمض النووي ثنائي السلاسل الموسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم. أدى التحضين لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية إلى إطلاق أقل من 1.0% من العدّات القابلة للذوبان في حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك.

تم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلاسل في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي pBR322 و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم. لم يُسفر التحضين لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية عن أي تحول مرئي إلى حمض نووي دائري منقوص، وذلك وفقًا لنتائج الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز.

تم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- وسم نهايات 5′ للحمض النووي DNA أو RNA لاستخدامها كمجسات تهجين في رسم خرائط النسخ باستخدام النيوكليازات في التسلسل
- كمجسات تهجين
- في رسم خرائط النسخ باستخدام النيوكليازات
- في التسلسل
- فسفرة روابط قليل النوكليوتيدات أو جزيئات الحمض النووي الأخرى قبل الربط
- بادئات أوليغوديوكسي نيوكليوتيد ذات علامات طرفية لاستخدامها في تفاعلات التسلسل
- إزالة الفوسفات من نهايات 3′ للحمض النووي الريبي في غياب الأدينوسين ثلاثي الفوسفات
- في تفاعل تبادل لوسم النهايات 5′ لجزيئات الحمض النووي DNA أو RNA التي تحتوي على فوسفات 5′ غير موسومة

- كمجسات تهجين
- في رسم خرائط النسخ باستخدام النيوكليازات
- في التسلسل

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: