كياجين، Y9080L، إندونوكلياز VIII (10000 وحدة)

10000 وحدة من إندونوكلياز VIII (1 مل من 10000 وحدة/مل) و10x محلول منظم إندونوكلياز VIII (1 × 1.5 مل).

سمات

- يستأصل البيريميدينات التالفة من الحمض النووي المزدوج
- يقوم بقطع مواقع AP تاركًا مجموعات فوسفات طرفية عند النهايتين 5' و 3'

تفاصيل المنتج

يعمل إنزيم إندونوكلياز VIII في بكتيريا الإشريكية القولونية كإنزيم N-جليكوزيلاز عن طريق استئصال آفات القواعد المؤكسدة وتكوين موقع AP، وكإنزيم AP-لياز عن طريق شطر العمود الفقري للفوسفودايستر وترك مجموعات فوسفات طرفية عند النهايتين 5' و3' (1). تشمل القواعد التالفة التي يزيلها إنزيم إندونوكلياز VIII اليوريا، و5،6-ثنائي هيدروكسي ثيمين، وثايمين جلايكول، و5-هيدروكسي-5-ميثيل هيدانتون، ويوراسيل جلايكول، و6-هيدروكسي-5،6-ثنائي هيدريمين، وميثيل تارترونيل يوريا (2).

يتم توفير هذا الإنزيم في 10 ملي مولار من Tris-HCl، و250 ملي مولار من NaCl، و0.1 ملي مولار من EDTA، و50% من الجلسرين؛ درجة الحموضة 8.0 عند 25 درجة مئوية.

عند درجة حرارة 25 درجة مئوية ودرجة حموضة 8.0، يتكون المحلول المنظم 10x لإنزيم Endonuclease Vlll من 100 ملي مولار من Tris-HCl، و750 ملي مولار من NaCl، و10 ملي مولار من EDTA.

أداء

الاختبار: الكمية المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 10 وحدات
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 100 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 100 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 29845 دالتون

مبدأ

يتم إنتاج البروتين الإنزيمي المؤتلف بواسطة سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية التي تحمل جين الإندونوكلياز الثامن المستنسخ.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لقطع 1 بيكومول من جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج يحتوي على موقع AP واحد في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

إجراء

- يوصى باستخدام محلول التفاعل Endonuclease VIII بتركيز 1x، ولكن هذا الإنزيم نشط في معظم محاليل التفاعل البيولوجي الجزيئي.
- أضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم Endonuclease VIII إلى تفاعل يحتوي على ركيزة DNA.
- حضّن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- يمكن إجراء عملية التعطيل الحراري عند درجة حرارة 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

تعليمات الاستخدام

ملاحظة: يمكن تعديل البروتوكول لاستخدامه في تطبيقات محددة.

ضبط الجودة

تم قياس النشاط النوعي لإنزيم إندونوكلياز VIII باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. حُضِّرت تخفيفات الإنزيم في محلول تخزينه في الجلسرين، وأُضيفت إلى تفاعلات حجمها 10 ميكرولتر تحتوي على 2.0 ميكرومول من أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 34 قاعدة، مُوسَم بـ FAM، ويحتوي على يوراسيل واحد. تجدر الإشارة إلى أنه تم معالجة الركيزة مسبقًا لمدة دقيقتين بوحدة واحدة من UDG لإنشاء موقع خالٍ من القاعدة. حُضِّنت التفاعلات لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم وُضِعت على الجليد، وخُضِّعت لعملية التمسخ باستخدام ثنائي ميثيل فورماميد NN، وحُلِّلت عن طريق تشغيل هلام أكريلاميد بنسبة 15% مُحضَّر من TBE-يوريا، وتعريضه للأشعة فوق البنفسجية قصيرة الموجة.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- استئصال البيريميدينات التالفة من الحمض النووي المزدوج
- شطر مواقع AP تاركًا فوسفات 3ʹ و 5ʹ
- قياس تلف الحمض النووي من خلال الرحلان الكهربائي الهلامي للخلايا المفردة أو اختبار المذنب (3)

- ديزدار أوغلو، م.، وآخرون، (1993) الكيمياء الحيوية، 32:12105.
- حتاحت، ز.، وآخرون. (1994) ج. بيول. الكيمياء، 269:18814.
- DOI: 10.1385/MB:26:3:249

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع