كياجين، Y9130L، بروتين الجين 32 T4

1.0 ملغ بروتين جين T4 32 (0.1 مل بتركيز 10 ملغ/مل)

سمات

- يعمل على تثبيت المناطق أحادية السلسلة من الحمض النووي
- يعزز إجراءات تسلسل الحمض النووي في المناطق الغنية بالبنية الثانوية
- يزيد من كفاءة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
- يحفز معدل تخليق بوليميراز الحمض النووي T4 على ركائز أحادية السلسلة مُهيأة مسبقًا

تفاصيل المنتج

إن بروتين الجين 32 الأصلي من العاثية T4 (T4gp32) هو بروتين ربط الحمض النووي أحادي السلسلة وهو ضروري لتضاعف الحمض النووي T4 وإعادة تركيبه وإصلاحه.

أظهر بروتين الجين 32 من النوع T4 قدرةً على تحسين أداء العديد من الأنشطة المتعلقة بتخليق الحمض النووي في المناطق الغنية بالبنية الثانوية، بما في ذلك تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتسلسل الحمض النووي. ويمكن تحقيق إنتاجية وجودة أفضل للقوالب باستخدام البروتينات الرابطة للحمض النووي في تفاعلات التضخيم والتسلسل. كما يحفز بروتين الجين 32 من النوع T4 معدل تخليق بوليميراز الحمض النووي T4 على ركائز أحادية السلسلة مُهيأة، مما يُظهر زيادة في معدل التخليق تتراوح بين 5 و10 أضعاف.

يتم توفير المنتج في 20 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 0.5 ملي مولار DTT، 1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين؛ درجة الحموضة 8.0 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الفحص: المواصفات
النقاء: >99%
ارتباط الحمض النووي: وظيفي
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 100 ميكروغرام <1.0% مُحرر
إنزيم إكسونيوكلياز ثنائي السلسلة: 100 ميكروغرام <1.0% مُحرر
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 100 ميكروغرام = لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 25 ميكروغرام <10 نسخ

مبدأ

بروتين الجين 32 من العاثية T4 هو بروتين يرتبط بالحمض النووي أحادي السلسلة، ووظيفته تثبيت المناطق أحادية السلسلة من الحمض النووي. وتستند قدرة هذا البروتين على تعزيز أداء العديد من الأنشطة المتعلقة بتخليق الحمض النووي إلى دوره الأساسي في تضاعف العاثية T4.

يرتبط البروتين gp32 بشكل مؤقت وتعاوني بتسلسلات قالب الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) عندما تُكشف هذه التسلسلات بواسطة إنزيم الهيليكاز المُعالِج الذي يعمل ضمن مُركَّب التضاعف. يضع هذا الارتباط تسلسلات الحمض النووي أحادي السلسلة في هيئات مثالية للتفاعل مع بوليميرازات الحمض النووي وبروتينات التضاعف الأخرى. من خلال تغطية هذه التسلسلات المكشوفة مؤقتًا، يحميها gp32 أيضًا من التحلل بواسطة النيوكليازات أثناء قيامها بوظائفها في كتابة القوالب (وغيرها) بالارتباط مع بوليميرازات الحمض النووي للسلسلة الرائدة والمتأخرة.

إجراء

تتوفر تعليمات استخدام بروتين T4 Gene 32 في بروتوكول المجموعة المقابل في الموارد أدناه.

ضبط الجودة

تم قياس ارتباط بروتين T4 Gene 32 بالحمض النووي أحادي السلسلة باستخدام اختبار إزاحة الهلام مع قليل النوكليوتيدات أحادي السلسلة الموسوم بصبغة فلورية. تم تحضير تخفيفات متسلسلة من الإنزيم في محلول تفاعل T4 GP32 بتركيز 1X (50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 1 ملي مولار DTT؛ الرقم الهيدروجيني 7.9) وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 10 ميكرولتر تحتوي على ركيزة قليل النوكليوتيدات الموسومة بـ 5'-FAM، ومحلول تفاعل T4 GP32 بتركيز 1X. حُضنت التفاعلات لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وفُصلت على هلام TBE-يوريا بتركيز 15%. لُوحظت قدرة ارتباط الحمض النووي من خلال تغير في الوزن الجزيئي الظاهري لقليل النوكليوتيدات على هلام TBE-يوريا.

تم تحديد تركيز البروتين (OD 280) لبروتين T4 Gene 32 عن طريق امتصاص OD 280.

تم تقييم النقاء الفيزيائي للمنتج باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل إنزيمية مركزة ومخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. وقد تم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة حزمة البروتين المطلوب في العينة المخففة.

تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من المحلول الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول البروتين تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول البروتين وتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول البروتين الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات التي تتوافق مع موضع 16S rRNA.

التطبيقات

- زيادة كفاءة الإنزيمات، مثل بوليميراز الحمض النووي Taq، والناسخ العكسي، والتيلوميراز
- تعزيز تخليق الحمض النووي بواسطة بوليميراز الحمض النووي
- تقليل تأثير المواد المثبطة في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
- تعزيز الطفرات الموجهة للموقع
- إزالة الحزم الزائدة أثناء التسلسل
- وضع علامات على الحمض النووي أحادي السلسلة للمجهر الإلكتروني

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: