شركة كياجين، Y9140-HC-L، مزيج إصلاح الأطراف (تركيز عالٍ)

لـ 75 تفاعل DNA عالي التركيز. مزيج إصلاح النهاية 10X (0.075 مل)، ومحلول إصلاح النهاية 10X (1 × 1.5 مل) ومحلول dNTPs 1 مليمولار (0.5 مل).

سمات

- يستغل نشاطي بوليميراز الحمض النووي T4 من 5′ إلى 3′ ونشاطي إكسونوكلياز من 3′ إلى 5′
- يتضمن كيناز عديد النوكليوتيد T4 لفسفرة نهايات الحمض النووي غير المتداخلة عند الطرف 5′
- تركيبة منخفضة التركيز تُحضّر ≤1 ميكروغرام من الحمض النووي لربط النهايات غير المتداخلة
- تركيبة عالية التركيز تُحضّر أكثر من 1 ميكروغرام من الحمض النووي لربط النهايات غير المتداخلة
- الحمض النووي ذو الأطراف غير المدببة مناسب للربط الفوري بواسطة إنزيم T4 DNA Ligase

تفاصيل المنتج

يحوّل مزيج إصلاح النهايات الحمض النووي الذي يحتوي على نهايات تالفة أو غير متوافقة بارزة من 5′ و/أو 3′ إلى حمض نووي ذي نهايات غير لاصقة ومُفسفرة عند 5′. ويتم هذا التحويل إلى حمض نووي ذي نهايات غير لاصقة من خلال استغلال نشاطي بوليميراز الحمض النووي T4 (P7080) من 5′ إلى 3′ وإكسونوكلياز من 3′ إلى 5′. ويضمن كيناز عديد النوكليوتيد T4 (Y9040) فسفرة نهايات شظايا الحمض النووي ذات النهايات غير اللاصقة عند 5′ لربطها لاحقًا بواسطة ليغاز الحمض النووي T4.

يمكن إجراء عملية الربط على الفور باستخدام إنزيم الربط السريع T4 DNA (L6030-HC).

تم تحسين تركيبة مزيج إصلاح النهاية منخفضة التركيز لإجراءات مثل الاستنساخ العام باستخدام تركيزات منخفضة من الحمض النووي.

تم تحسين تركيبة مزيج إصلاح النهاية عالية التركيز لإجراءات مثل بناء المكتبة لتسلسل الجيل التالي باستخدام تركيزات عالية من الحمض النووي.

لا يلزم وجود ATP لأن إنزيم T4 Polynucleotide Kinase يمكنه استخدام الديوكسي نيوكليوتيدات (dATP و dTTP) المستخدمة في مزيج تفاعل التثبيط كمتبرعات للفوسفات.

يتم توفير مزيج الإنزيمات في 100 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم، و10 ملي مولار من Tris-HCl، و0.1 ملي مولار من EDTA، و1 ملي مولار من DTT، و0.1% من Triton X-100، و50% من الجلسرين؛ درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية.

يتم تزويد مزيج الإنزيم بـ 1 ملي مول من dNTPs (N2060) و 10X End-Repair Buffer (B9140) الذي يحتوي على 1 مول من Tris-HCl، و 500 ملي مول من NaCl، و 100 ملي مول من MgCl2، و 50 ملي مول من DTT، و 0.25٪ من Triton X-100؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: المواصفات
النقاء: >99%
نوكلياز 3'→5': وظيفي
الفسفرة عند الطرف 5': وظيفية
تخليق الحمض النووي من 5' إلى 3': وظيفي
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 10 ميكرولتر = لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 10 ميكرولتر <10 نسخ

مبدأ

يُنتج مزيج إصلاح النهايات الحمض النووي DNA المُفسفر عند الطرف 5′ ذو النهايات غير المتداخلة، وذلك بإصلاح الحمض النووي DNA ذي النهايات التالفة أو غير المتوافقة ذات النهايات البارزة عند الطرف 5′ و/أو الطرف 3′. ويتم تحويل الحمض النووي DNA إلى نهايات غير متداخلة من خلال استغلال نشاطي بوليميراز 5′→3′ وإكسونوكلياز 3′→5′ لإنزيم بوليميراز الحمض النووي T4 (P7080). ويضمن عمل إنزيم كيناز عديد النوكليوتيد T4 (Y9040) الموجود في المزيج فسفرة نهايات شظايا الحمض النووي DNA ذات النهايات غير المتداخلة عند الطرف 5′، مما يُسهل عملية الربط اللاحقة. ويمكن ربط الحمض النووي DNA المُصلح بكفاءة وسرعة في البلازميدات، والكوزميدات، والفوسميدات، وBAC، وغيرها من نواقل الاستنساخ، أو محولات تسلسل الحمض النووي DNA من الجيل التالي.

إجراء

تتوفر تعليمات استخدام مزيج إصلاح الأطراف (بتركيز عالٍ ومنخفض) في بروتوكول المجموعة المقابل في الموارد أدناه.

ضبط الجودة

تخلو الإنزيمات المنقاة في مزيج إصلاح النهايات (بوليميراز الحمض النووي T4 P7040 وكينيز عديد النوكليوتيد T4 Y9040) من أي نوكليازات داخلية ملوثة. علاوة على ذلك، تم تحليل نقاء الإنزيم بنسبة تزيد عن 99% باستخدام تقنية SDS-PAGE. كما تم تأكيد وجود كمية ضئيلة من الحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام تقنية qPCR.

في اختبار وظيفي، أُضيف 2 ميكرولتر من مزيج إصلاح النهايات إلى بلازميد DNA منزوع الفوسفات، مُهضّم بواسطة إنزيمين تقييديين، في محلول تفاعل 1X يحتوي على 0.1 ملي مول من dNTPs، وحُضنت العينات عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم حُوّلت الخلايا المؤهلة باستخدام مزيج الربط، وزُرعت على أطباق LB/Amp/X-Gal، وحُضنت طوال الليل عند 37 درجة مئوية. وبالتوازي، اختُبرت تفاعلات تحكم تتكون من مزيج إصلاح النهايات بدون بوليميراز DNA T4 و/أو كيناز عديد النوكليوتيد T4. وقُيِّمت كفاءة التفاعل بمقارنة عدد المستعمرات الزرقاء والبيضاء الموجودة في أطباق مزيج إصلاح النهايات مع تلك الموجودة في أطباق التحكم.

التطبيقات

- تحضير الحمض النووي الجينومي المقطّع أو المهضوم بواسطة إنزيمات التقييد لربط محولات تسلسل الحمض النووي من الجيل التالي
- تحضير الحمض النووي التكميلي ثنائي السلسلة، المُنتَج من نسخ الحمض النووي الريبوزي الخلوي، لربط محولات تسلسل الحمض النووي من الجيل التالي
- تحضير الحمض النووي المقطّع أو المهضوم لربطه بنهايات غير لاصقة في البلازميد، أو الكوزميد، أو الفوسميد، أو ناقلات BAC
- تحضير الحمض النووي المُضخّم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والذي يحتوي على نهايات A بارزة، من أجل استنساخ النهايات غير المتداخلة بكفاءة وفعالية من حيث التكلفة

تتوفر هذه المنتجات لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: