نظام كياجين، Y9180L، لفصل اليوراسيل (10x)

نظام انقسام اليوراسيل، بما في ذلك إندونوكلياز VIII (0.375 مل) وجليكوزيلاز اليوراسيل-DNA (0.375 مل).

سمات

- نظام ثنائي الإنزيم، يوراسيل دي إن إيه جليكوزيلاز (UDG) وإندونوكلياز VIII
- يحفز إنزيم UDG استئصال قاعدة اليوراسيل، مما يؤدي إلى إنشاء موقع خالٍ من القاعدة مع هيكل فوسفودايستر سليم
- يقوم الإندونوكلياز الثامن بكسر العمود الفقري للفوسفودايستر في كل من الاتجاهين 3' و 5' للموقع غير القاعدي، مما يؤدي إلى تحرير سكر الديوكسي ريبوز

تفاصيل المنتج

يُوفر نظام انشطار اليوراسيل إنزيمين، يُضافان تباعًا إلى تفاعل يحتوي على قطعة DNA اصطناعية تحتوي على ديوكسي يوراسيل، مما يُحدث فجوة نيوكليوتيدية واحدة في موقع بقايا اليوراسيل. يُضاف كل من مُكوني الإنزيم، غليكوزيلاز اليوراسيل DNA وإندونوكلياز VIII، بتركيز 10 أضعاف، إلى تفاعل يحتوي على تسلسل عديد النيوكليوتيدات المحتوي على اليوراسيل. يُحفز إنزيم UDG استئصال قاعدة اليوراسيل، مُنشئًا موقعًا خاليًا من القاعدة مع هيكل فوسفودايستر سليم (1-2). يعمل نشاط اللياس لإنزيم إندونوكلياز VIII على كسر هيكل الفوسفودايستر، من الطرفين 3' و5'، وصولًا إلى الموقع الخالي من القاعدة، مُحررًا سكر ديوكسي ريبوز (3-4).

يتم توفير UDG في 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA و 50% جلسرين؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

يتم توفير إنزيم Endonuclease VIII في محلول يحتوي على 10 ملي مولار من Tris-HCl، و250 ملي مولار من NaCl، و0.1 ملي مولار من EDTA، و50% من الجلسرين؛ درجة الحموضة 8.0 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: الكمية المختبرة
النقاء: غير متوفر
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 10 ميكرولتر
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 10 ميكرولتر
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 10 ميكرولتر
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 5 ميكرولتر

مبدأ

يتم إنتاج البروتينات وتنقيتها بشكل منفصل من سلالات الإشريكية القولونية التي تحتوي على جينات إندونوكلياز VIII المؤتلفة وجينات يوراسيل-DNA جليكوزيلاز.

تُعرَّف وحدة واحدة من UDG بأنها كمية الإنزيم التي تحفز إطلاق 1.8 نانومول من اليوراسيل في 30 دقيقة من الحمض النووي المزدوج السلسلة، والموسوم بالتريتيوم، والذي يحتوي على اليوراسيل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في محلول تفاعل UDG 1x.

تُعرَّف وحدة واحدة من إندو نوكلياز VIII بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لقطع 1 بيكومول من جزيء أوليغونوكليوتيد مزدوج يحتوي على موقع AP واحد في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

إجراء

تعليمات الاستخدام

يمكن تعديل الحجم ليناسب متطلبات التطبيق من خلال الحفاظ على نسب المكونات الموضحة أدناه لتفاعل بحجم 10 ميكرولتر.

1. تحضير الحمض النووي المحتوي على اليوراسيل (مثل ناتج تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل). إنزيمات نظام انقسام اليوراسيل نشطة في معظم محاليل تفاعلات البيولوجيا الجزيئية، لذا لا داعي لتغيير المحاليل قبل بدء تفاعل الانقسام.

2. أضف 0.5 ميكرولتر من UDG (G5010L) إلى وعاء التفاعل الذي يحتوي على ركيزة الحمض النووي (التركيز النهائي يصل إلى 300 نانومتر) في محلول التفاعل 1x.

3. أضف 0.5 ميكرولتر من إندونوكلياز VIII (Y9080L) إلى ما سبق.

4. حضّن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

٥. بعد فترة الحضانة، يمكن إيقاف التفاعل بإضافة محلول إيقاف التحميل على الهلام استعدادًا للتحليل الكهربائي أو تحضيره للتحويل. في حالة التحويل، يمكن ربط القطعة بناقل الاستنساخ باستخدام إنزيم T4 DNA Ligase (L6030-HC).

ضبط الجودة

تم قياس النشاط النوعي لإنزيم UDG باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. خُفف الإنزيم في محلول تفاعل بتركيز 1x، ثم أُضيف إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على محلول تفاعل UDG بتركيز 1x وناتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، وهو 3H-dUTP. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة الترسيب بحمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA).

تم قياس النشاط النوعي لإنزيم إندونوكلياز VIII باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول منظم للتفاعل بتركيز 1x، وأُضيفت إلى تفاعلات حجمها 10 ميكرولتر تحتوي على 2.0 ميكرومول من أوليغونوكليوتيد مزدوج مكون من 34 قاعدة، موسوم بـ FAM، ويحتوي على يوراسيل واحد. تمت معالجة الركيزة مسبقًا لمدة دقيقتين باستخدام UDG لإنشاء موقع خالٍ من القاعدة. حُضنت التفاعلات لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وخُضعت لعملية التمسخ باستخدام NN-ثنائي ميثيل فورماميد، وحُللت على هلام أكريلاميد يحتوي على 15% من TBE-يوريا.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة لكل إنزيم على حدة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة لكل إنزيم على حدة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة v في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و 10 ميكرولتر من محلول الإنزيم تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- الاستنساخ

- ليندال، T.، وآخرون. (1977) ج. بيول. الكيمياء. 252:3286.
- ليندال، ت. (1982) آنو. القس الكيمياء الحيوية. 51:61.
- Melamede, RJ, et al. (1994) Biochemistry 33:1255.
- جيانغ، د.، وآخرون. (1997) ج. بيول. الكيمياء. 272:32230.

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع