كياجين، Y9220L، RNase H (5000 وحدة)

RNase H (1 مل عند 5000 وحدة/مل) و 10X RNase Buffer (2 × 1.5 مل)

سمات

- مفيد لإزالة الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) أثناء تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من السلسلة الثانية
- ينتج جزيئات ريبونوكليوتيد ذات نهايات فوسفاتية 5' وهيدروكسيلية 3'

تفاصيل المنتج

إنزيم RNase H (rnh) في بكتيريا الإشريكية القولونية هو إنزيم داخلي يُحلل سلسلة الحمض النووي الريبوزي (RNA) في جزيئات الحمض النووي الريبوزي/الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (RNA/DNA) الهجينة (1،2). ينتج عن هضم RNase H جزيئات ريبونوكليوتيد ذات نهايات فوسفاتية 5' وهيدروكسيلية 3'. ويكون RNase H غير فعال تقريبًا تجاه جزيئات الحمض النووي الريبوزي أحادية أو ثنائية السلسلة.

متوفر في: 20 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 0.1 ملي مولار DTT، 10 ملي مولار MgCl2، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية)

مرفق مع: محلول منظم RNase H 10X (B9220): 500 ملي مولار Tris-HCl، 750 ملي مولار KCl، 30 ملي مولار MgCl2، 100 ملي مولار DTT (الأس الهيدروجيني 8.3 عند 25 درجة مئوية)

أداء

الاختبار: الكمية المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 500 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 500 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 500 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 500 وحدة
إنزيم RNase غير النوعي: 500 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 18.1 كيلو دالتون

مبدأ

يتم تنقية الإنزيم من سلالة E. coli المؤتلفة التي تحمل جين RNase H (rnh) من E. coli.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستحلل 1 نانومول من الحمض النووي الريبي من جزيء هجين من الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي المسمى بـ 3H إلى مادة قابلة للذوبان في الأحماض في 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

إجراء

المكونات: التركيز النهائي
ماء خالٍ من النيوكلياز: غير متوفر
محلول منظم RNase H بتركيز 10X (B9220): 1X
الحمض النووي الريبي: الحمض النووي المزدوج: 2 ميكروغرام
إنزيم RNase H (Y9220L): 5 وحدات
الحجم الكلي = 100 ميكرولتر

- حضّر مزيج التفاعل التالي بحجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر: المكونات التركيز النهائي الحجم ماء خالٍ من النيوكلياز N/AX ميكرولتر محلول منظم RNase H بتركيز 10X (B9220) 1X 10 ميكرولتر جزيء RNA:DNA مزدوج 2 ميكروغرام X ميكرولتر RNase H (Y9220L) 5 وحدات 1 ميكرولتر الحجم الإجمالي = 100 ميكرولتر
- قم بحضانة التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- أوقف التفاعل بإضافة 1 ميكرولتر من EDTA بتركيز 0.5 مولار.

تعليمات الاستخدام

ضبط الجودة

يُقاس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول منظم لتفاعل RNase H بتركيز 1X، وأُضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على 3 جزيئات DNA موسومة بالنظير المشع (3H) من نوع poly(rA) وpoly(dT)، ومحلول منظم لتفاعل RNase H بتركيز 1X. حُضنت التفاعلات لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وجرى تحليل كمية الجزيئات الذائبة الناتجة عن تفاعل TCA.

يتم تحديد تركيز البروتين (OD 280) عن طريق امتصاص OD 280.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويتم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة حزمة البروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم ويتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم تلوث الحمض النووي الريبوزي 16S لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات التي تتوافق مع موضع الحمض النووي الريبوزي 16S.

يتم تقييم التلوث غير المحدد بـ RNase باستخدام مجموعة RNase Alert (Integrated DNA Technologies)، وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة.

التطبيقات

- تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي
- تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)
- RT-qPCR

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع

1. دونيس-كيلر، هـ. (1979) أبحاث الأحماض النووية، 7، 179. 2. شولتز، إس جيه وشامبو، جيه جيه (2008) أبحاث الفيروسات، 134(1-2): 86-103.