كياجين، Y9240L، مثبط إنزيم RNase (20000 وحدة)

٢٠٠٠٠ وحدة من مثبط إنزيم RNase (٠٫٥ مل بتركيز ٤٠٠٠٠ وحدة/مل). درجة حرارة التخزين: من -٢٥ درجة مئوية إلى -١٥ درجة مئوية

سمات

- مثبط غير تنافسي للريبونوكليازات من النوع البنكرياسي، مثل RNases A وB وC
- بروتين حمضي، وزنه 52 كيلو دالتون، يتم التعبير عنه باستخدام تقنية إعادة التركيب في بكتيريا الإشريكية القولونية الحاملة لجين مثبط إنزيم الريبونوكلياز الخنزيري
- لا يثبط أنواعًا أخرى من إنزيمات الريبونوكلياز والإنزيمات المعدلة مثل البوليميراز والناسخ العكسي.

تفاصيل المنتج

مثبط RNase هو بروتين حمضي بوزن 52 كيلو دالتون، وهو مثبط قوي غير تنافسي للريبونوكليازات من النوع البنكرياسي مثل RNase A و RNase B و RNase C. يتم توفير الإنزيم على شكل اندماج لجين مثبط RNase الخنزيري مع علامة بروتينية خاصة بوزن 22.5 كيلو دالتون.

يتم توفير الإنزيم في 20 ملي مولار هيبس-KOH، 50 ملي مولار KCl، 8 ملي مولار DTT، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الفحص: المواصفات
النقاء: >99%
النشاط النوعي: 53333 وحدة/ملغ
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 2000 وحدة: أقل من 5.0% مُحرر
إنزيم إكسونوكلياز ثنائي السلسلة: 2000 وحدة: أقل من 1.0% مُحرر
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 2000 وحدة؛ لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 2000 وحدة: أقل من 10 نسخ
تلوث RNase: 2000 وحدة: لا يوجد RNase غير محدد قابل للكشف

مبدأ

يثبط هذا الإنزيم على وجه التحديد إنزيمات RNase A وB وC. ويثبطها عن طريق الارتباط غير التساهمي بنسبة 1:1 وبألفة عالية. ولا يتداخل مع أنشطة إنزيمات RNase الأخرى والإنزيمات المعدلة مثل البوليميراز والناسخ العكسي.

إجراء

تتوفر تعليمات استخدام مثبط RNase في بروتوكول المجموعة المقابل في الموارد أدناه.

ضبط الجودة

تم تحديد نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول منظم لتفاعل مثبط RNase بتركيز 1X، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 1000 ميكرولتر تحتوي على 1 ملي مول من سيتيدين 2'،3'-أحادي الفوسفات الحلقي، و1 ميكروغرام من RNase A في محلول منظم للتفاعل بتركيز 1X يحتوي على 100 ملي مول من أسيتات التريس، و1 ملي مول من EDTA، عند درجة حموضة 6.5. تم قياس الامتصاص عند 286 نانومتر على فترات 20 ثانية خلال تفاعل مدته 5 دقائق.

تم تحديد تركيز البروتين باستخدام عينة من الإنزيم بحجم 2.0 ميكرولتر تم تحليلها عند OD 280 باستخدام مطياف نانودروب ND-1000 تم معايرته باستخدام عينة BSA بتركيز 2.0 ملغم/مل وتمت تصفيته باستخدام محلول تخزين المنتج.

تم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام 2.0 ميكرولتر من محلول إنزيمي مركز مُحمّل على هلام SDS-PAGE مُشوه بنسبة 4-20% من Tris-Glycine، مُحاط بعلامة وزن جزيئي واسعة النطاق، و2.0 ميكرولتر من عينة مُخففة بنسبة 1:100. بعد الفصل الكهربائي، تم تلوين الهلام ومقارنة العينات لتحديد النقاء الفيزيائي. تتطلب معايير القبول لهذا الاختبار ألا تتجاوز الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة كتلة حزمة البروتين المطلوب في العينة المخففة، مما يؤكد نقاء العينة المركزة بنسبة تزيد عن 99%.

تم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على 10000 عد في الدقيقة من ركيزة الحمض النووي أحادي السلسلة المشعة و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 5000 عد في الدقيقة من ركيزة الحمض النووي ثنائي السلسلة المشعة و 10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي pBR322 و 10 ميكرولتر من محلول الإنزيم وتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم، وتمت معالجتها وفحصها في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- عزل وتنقية الحمض النووي الريبي (RNA)
- تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)
- تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي (RT-qPCR)
- النسخ والترجمة في المختبر
- إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخالية من إنزيم RNase

يُستخدم هذا الإنزيم في التطبيقات التي قد يشكل فيها وجود إنزيمات الريبونيوكلياز خطرًا على جودة الحمض النووي الريبي ونتائج التجارب: