شركة كياجين، Y9370L، بيروفوسفاتاز مقاوم للحرارة (1250 وحدة)

1250 وحدة من البيروفوسفاتاز المقاوم للحرارة (0.625 مل عند 2000 وحدة/مل)

سمات

- تحلل البيروفوسفات غير العضوي لإنتاج الأورثوفوسفات
- قيمة K m منخفضة (5.4 ميكرومتر)
- نشط عند درجة حموضة 7-9
- درجة الحرارة المثلى للنشاط هي 75 درجة مئوية

تفاصيل المنتج

إنزيم البيروفوسفاتاز المقاوم للحرارة هو إنزيم مُعاد التركيب من بكتيريا Sulfolobus acidocaldarius، يحفز التفاعل المعتمد على أيونات المغنيسيوم (Mg2+) للتفاعل التالي: P2O7-4 + H2O → 2HPO4-2. يتميز هذا الإنزيم بانخفاض قيمة ثابت ميكايليس (Km) للبيروفوسفات (5.4 ميكرومولار)، ويكون نشطًا عند درجة حموضة تتراوح بين 7 و9، ودرجة حرارة مثلى لنشاطه تبلغ 75 درجة مئوية، كما أنه فعال في ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (1-3).

متوفر في: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية)

أداء

الاختبار: الكمية المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 50 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 50 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 50 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 50 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 19.4 كيلو دالتون

مبدأ

يتم إنتاج البروتين بواسطة سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية تحمل جين البيروفوسفاتاز المقاوم للحرارة من بكتيريا S. acidocaldarius.

الوحدة الواحدة هي كمية الإنزيم التي ستحرر 1 ميكرومول من الفوسفات في الدقيقة من البيروفوسفات غير العضوي عند 75 درجة مئوية ودرجة حموضة 8.5.

إجراء

تعليمات الاستخدام

يُمكن لإنزيم البيروفوسفاتاز المقاوم للحرارة أن يُقلل من التأثيرات المُثبطة لتراكم البيروفوسفات (PPi) في تفاعلات البوليميراز المتسلسل (PCR) (5-7). كنقطة بداية لتفاعل PCR، أضف 0.01-0.1 وحدة/ميكرولتر من إنزيم البيروفوسفاتاز المقاوم للحرارة لتحديد التركيز الأمثل. ملاحظات: يعتمد تحفيز إنزيم البيروفوسفاتاز المقاوم للحرارة على أيونات المغنيسيوم (Mg²⁺). لذلك، من المهم وجود أيونات المغنيسيوم في محلول التفاعل. وهو متوافق مع معظم محاليل تفاعل PCR التي تحتوي على أيونات المغنيسيوم.

ضبط الجودة

نشاط الوحدة

يعتمد هذا التحليل على الطريقة الموصوفة من قِبل تاوسكي وشور (4). باختصار، تُضاف تخفيفات الإنزيم إلى محلول يحتوي على 30 ملي مولار من Tris HCl بدرجة حموضة 8.5، و1.5 ملي مولار من MgCl₂، و1.5 ملي مولار من بيروفوسفات الصوديوم. بعد حضانة لمدة 10 دقائق عند 75 درجة مئوية، يتفاعل الناتج المتكون، وهو 2-أورثوفوسفات، مع موليبدات الأمونيوم لتكوين حمض الفوسفوموليبديك. ثم يُختزل حمض الفوسفوموليبديك بواسطة كبريتات الحديدوز في ظروف حمضية ضعيفة لتكوين لون أزرق، ويُقاس امتصاصه عند 660 نانومتر. تُستنتج كمية الناتج المتكون من منحنى معايرة الفوسفات الناتج عن تفاعل موليبدات الأمونيوم مع كبريتات الحديدوز. يُحدد تركيز البروتين (OD 280) من خلال قياس الامتصاص عند 280 نانومتر. تُقيّم النقاوة الفيزيائية بواسطة الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعًا بالكشف باستخدام صبغة الفضة. يُقيّم نقاء العينة بمقارنة الكتلة الإجمالية للشوائب في العينة المركزة بكتلة البروتين المطلوب في العينة المخففة. يُحدد نشاط الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر، يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، ويُحضن لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. يُحدد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر، يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، ويُحضن لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. يتم تحديد الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، ويتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. يتم تقييم تلوث الحمض النووي الريبوزي 16S لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصل سلسلتيه وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات التي تتوافق مع موقع الحمض النووي الريبوزي 16S.

التطبيقات

- إنتاج الأورثوفوسفات
- تجنب التثبيط في تفاعلات تخليق وتعديل الحمض النووي الريبي
- تجنب التثبيط في تفاعلات البلمرة المتسلسلة (PCR)

- ليبانين، VM وآخرون. (1999) علوم البروتين، 8(6):1218-31.
- Hansen, T. et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys., 363(1):135-47.
- Meyer, W. et al. (1995) Arch. Biochem. Biophys., 319(1):149-56.
- تاوسكي، إتش إتش وشور، إي. (1953) مجلة الكيمياء البيولوجية، يونيو؛ 202 (2): 675-85.
- مولدس، C. وآخرون. (2004) تطبيق. البيئة. ميكروبيول، 70(8): 4642-4647.
- ديجنام، جيه دي ودويتشير، إم بي (1979) الكيمياء الحيوية، 18(14):3165-70.
- جيبسون، إن جيه وآخرون (1997) التحليل الكيميائي الحيوي، 254 (1): 18-22.

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع