كياجين، Y9380L، بيروفوسفاتاز الإشريكية القولونية (50 وحدة)

50 وحدة من إنزيم البيروفوسفاتاز من الإشريكية القولونية (0.5 مل عند 100 وحدة/مل)

سمات

- يحفز التحلل المائي للبيروفوسفات غير العضوي (PPi) لتكوين الأورثوفوسفات
- يؤدي إزالة البيروفوسفات (PPi) وتأثيراته المثبطة إلى تعزيز تفاعلات تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) والحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA).

تفاصيل المنتج

يحفز إنزيم البيروفوسفاتاز في بكتيريا الإشريكية القولونية التفاعل المعتمد على المغنيسيوم لـ P 2 O 7 -4 + H 2 O → 2HPO 4 -2 .

يتم توفير هذا الإنزيم في 20 ملي مولار من Tris-HCl (الأس الهيدروجيني 8.0)، و100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، و1 ملي مولار من DTT، و0.1 ملي مولار من EDTA، و50% من الجلسرين.

أداء

الاختبار: الوحدات المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 35 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 35 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 35 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 35 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 19704 دالتون

مبدأ

يُنتَج البروتين الإنزيمي المُعاد تركيبه بواسطة سلالة مُعاد تركيبها من بكتيريا الإشريكية القولونية تحمل جين البيروفوسفاتاز الخاص بها. الوحدة الواحدة هي كمية الإنزيم التي تُحرِّر 1 ميكرومول من الفوسفات في الدقيقة من البيروفوسفات غير العضوي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ودرجة حموضة 8.5.

إجراء

تعليمات الاستخدام

يُستخدم إنزيم البيروفوسفاتاز من بكتيريا الإشريكية القولونية على نطاق واسع في تفاعلات النسخ المختبري (IVT) أو تفاعلات تخليق الحمض النووي الريبوزي (RNA) لتقليل التأثيرات المثبطة للبيروفوسفات (PPi). كنقطة بداية لتفاعل تخليق الحمض النووي الريبوزي في المختبر، أضف 0.1-1 وحدة لكل مل من إنزيم البيروفوسفاتاز من بكتيريا الإشريكية القولونية لتحديد التركيز الأمثل.

ملحوظات:

يعتمد تحفيز البيروفوسفاتاز في بكتيريا الإشريكية القولونية على أيونات المغنيسيوم (Mg 2+)، لذلك من المهم وجود أيونات المغنيسيوم (Mg 2+) في محلول التفاعل.

مراجع:

1. لاهتي، ر. وآخرون. (1988) ج. باكتيريول، 170(12)، 5901-7.

2. بايكوف، أ.أ. وآخرون (1996) الكيمياء الحيوية، 35(15)، 4655-61.

3. تاوسكي، إتش إتش وشور، إي. (1953) مجلة الكيمياء البيولوجية، 202(2)، 675-85.

ضبط الجودة

تُضاف تخفيفات الإنزيم إلى محلول مكون من 30 ملي مولار من Tris HCl (الأس الهيدروجيني 8.5)، و1.5 ملي مولار من MgCl₂، و1.5 ملي مولار من بيروفوسفات الصوديوم. بعد حضانة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، يتفاعل الناتج المتكون، وهو 2-أورثوفوسفات، مع موليبدات الأمونيوم لتكوين حمض الفوسفوموليبديك. ثم يُختزل حمض الفوسفوموليبديك بواسطة كبريتات الحديدوز في ظروف حمضية ضعيفة لإنتاج لون أزرق، ويُقاس امتصاصه عند 660 نانومتر. يُستنتج الناتج المتكون من منحنى فوسفات قياسي مُستمد من تفاعل موليبدات الأمونيوم مع كبريتات الحديدوز. يعتمد هذا التحليل على ما وصفه تاوسكي وشور (3).

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- تخليق وتعديل الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA