شركة كياجين، Y9420L، مزيج إنزيمات ER/A-Tailing، 5x (24 تفاعلًا)

لـ 24 تفاعلًا (مجموعة التقييم): 5x مزيج إنزيم ER/A-Tailing (0.24 مل) و 10x محلول ERA (0.25 مل).

سمات

- يجمع بين إصلاح الأطراف وإضافة ذيل الأدينين في خطوة واحدة - للاستخدام مع الحمض النووي المجزأ
- متوافق مع كمية الحمض النووي المدخلة من 250 بيكوغرام إلى 1 ميكروغرام
- كفاءة عالية في استخدام المكتبة وإنتاجية عالية
- معدلات تكرار منخفضة
- التجانس عبر نطاق واسع من محتوى GC
- متوافق مع الحمض النووي المدخل الذي يحتوي على EDTA

تفاصيل المنتج

مزيج إنزيمات ER/A Tailing هو وحدة تحضير مكتبات تسلسل الجيل التالي (NGS). تستخدم هذه الوحدة تفاعلًا أحادي الخطوة يجمع بين إصلاح الأطراف وإضافة ذيل dA لتحويل الحمض النووي المجزأ إلى شظايا DNA مُفسفرة عند الطرف 5' ومُضاف إليها ذيل dA عند الطرف 3'، مما يُتيح الربط المباشر لمحولات تسلسل Illumina. عند استخدامها مع وحدة ربط WGS (رقم المنتج L6030-WL)، تضمن التركيبة الكيميائية المُحسّنة حساسية عالية لكميات قليلة من الحمض النووي المُدخل، وكفاءة ربط عالية لتحقيق أقصى إنتاجية للمكتبة، وسير عمل لا يتجاوز 3 ساعات مع أقل من 45 دقيقة من العمل اليدوي.

يتم تزويد مزيج إنزيم ذيل ER/A بمحلول ERA Buffer 10x (رقم المنتج B9420).

أداء

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية

خصائص الإنزيم

مبدأ

توفر الكيمياء والبروتوكول المُحسّنان سير عمل مُبسّطًا يضمن حساسية وكفاءة عاليتين لمجموعة واسعة من مدخلات الحمض النووي، مع زيادة إنتاجية المكتبة إلى أقصى حد. يوفر مزيج إنزيمات ER/A-Tailing حلاً مرنًا للمكتبة يُلبي متطلبات الجودة والسرعة والإنتاجية، مع الحفاظ على كونه خيارًا فعالًا من حيث التكلفة لعمليات التسلسل الصغيرة والكبيرة.

متوافق مع عينات الحمض النووي الجينومي (gDNA) والحمض النووي التكميلي (cDNA) وعينات الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين (FFPE/FF).

إجراء

الخطوة: درجة حرارة الحضانة (°م)
1: 4
2:20
3: 65
4: 4

حجم التفاعل الواحد (ميكرولتر)
مخزن ERA 10X: 5
عينة الحمض النووي: X
ماء خالٍ من النيوكلياز: (35–X)
المجموع: 40

أدخل البرنامج التالي في جهاز التدوير الحراري (انظر الجدول أدناه). تأكد من استخدام الغطاء المُسخّن للجهاز، وإذا أمكن، اضبط درجة حرارة الغطاء المُسخّن على 70 درجة مئوية. عندما تصل درجة حرارة كتلة جهاز التدوير الحراري إلى 4 درجات مئوية، أوقف البرنامج مؤقتًا. متوافق مع مدخلات الحمض النووي التي تبدأ من 250 بيكوغرام وتصل إلى 1 ميكروغرام في الماء أو محلول EB أو محلول TE بتركيز 1X. الخطوة درجة حرارة الحضانة (درجة مئوية) مدة الحضانة (دقائق) 1 4 1 2 20 30 3 65 30 4 4 تثبيت
للحصول على أفضل النتائج، من المهم اتباع الإجراء الموضح أدناه. حضّر مزيج التفاعل في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) جديد ذي جدار رقيق، وضعه على الثلج، وذلك بمزج محلول ERA Buffer وعينة الحمض النووي والماء الخالي من النيوكلياز، كما هو موضح في الجدول لكل عينة حمض نووي. امزج جيدًا باستخدام الماصة برفق (لا تستخدم جهاز الخلط الدوامي). حجم التفاعل النهائي هو 50 ميكرولتر.

3. أضف 10 ميكرولتر من مزيج إنزيم ER/A-Tailing بتركيز 5X إلى كل تفاعل، واخلط جيدًا عن طريق سحب المحلول ودفعه بالماصة 6-8 مرات. يُنصح بوضع أنبوب تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) على الثلج طوال فترة تحضير التفاعل.

4. قم بتدوير أنبوب العينة بشكل متقطع وانقله فوراً إلى جهاز التدوير الحراري المبرد مسبقاً (4 درجات مئوية). استأنف برنامج التدوير.

5. عند اكتمال برنامج التدوير الحراري وعودة كتلة العينة إلى 4 درجات مئوية، قم بإخراج العينات من الكتلة وضعها على الجليد.

٦. انتقل مباشرةً إلى ربط المحولات. نوصي باستخدام إنزيم ربط WGS (رقم المنتج L6030-WL).

تحليل مراقبة الجودة

اختبار وظيفي لمزيج إنزيمات ER/A لتعديل الذيل: يجب أن يكون طول مكتبة مراقبة الجودة (QC) ضمن نطاق 15% من طول المكتبة المرجعية. يجب أن يكون تركيز مكتبة مراقبة الجودة المُستخلصة من 100 نانوغرام من الحمض النووي المُدخل (بمتوسط ​​قطع يبلغ طولها 300 زوج قاعدي تقريبًا) أكبر من 60 نانومتر، مع نسبة قراءات مُرتبطة تزيد عن 90%. بالنسبة لمكتبة مراقبة الجودة، يجب أن تكون التغطية المُعيرة ضمن نطاق 0.7 إلى 1.3 لمعظم أجزاء الجينوم (محتوى GC يتراوح بين 10% و80%).

تم اختبار مكونات الإنزيم قبل تجميعها، وثبت خلوها من أي ملوثات من الإنزيمات الداخلية والخارجية. بلغت نقاوة الإنزيم أكثر من 95% وفقًا لتحليل SDS-PAGE، وتم تأكيد انعدام التلوث بالحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR).

التطبيقات

- إعداد مكتبة NGS لمنصات Illumina

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: