مجموعة الكشف عن معقد IRAK1 / IRAK4 البشري من Revvity، ALSU-CIRAK-A-HV، AlphaLISA، 100 نقطة اختبار

ملخص
يُعدّ مُركّب IRAK1/IRAK4 وحدة إشارات حيوية في مسارات TLR وIL-1R، حيث يُساهم في الاستجابات المناعية الفطرية لمسببات الأمراض. عند تنشيط المُستقبل، يقوم MYD88 باستقطاب IRAK4، الذي بدوره يستقطب IRAK1 ويُفسفره، مُشكّلاً مُركّب كيناز نشط. يُفسفر IRAK4 بروتين IRAK1 في مواقع مُتعددة، مُحفّزاً الفسفرة الذاتية والتنشيط الكامل. يستقطب المُركّب المُنشّط بروتين TRAF6، مما يُؤدي إلى تنشيط مساري NF-κB وMAPK. يجري تطوير مُثبّطات مُزدوجة لـ IRAK1/IRAK4 كعلاجات مُضادة للالتهابات لأمراض المناعة الذاتية والأورام اللمفاوية المُتحوّرة في MYD88.
إن AlphaLISA SureFire Ultra Human IRAK1 / IRAK4 Complex عبارة عن فحص مناعي ساندويتش للكشف الكمي عن مركب IRAK1 / IRAK4 في مستخلصات الخلايا، باستخدام تقنية Alpha.
التنسيقات:

تحتوي مجموعة HV (عالية الحجم) على كواشف لتشغيل 100 بئر في تنسيق 96 بئر، باستخدام حجم تفاعل 60 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة الـ 500 نقطة على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 500 بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط العشرة آلاف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 10000 بئر بتنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط الخمسين ألف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 50 ألف بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.

تتوافق مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra مع:

مستخلصات الخلايا والأنسجة
مُعدِّلات الأجسام المضادة
الأجسام المضادة العلاجية البيولوجية

يمكن استخدام مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra للأغراض التالية:

فحوصات الكيناز الخلوي
دراسات تنشيط المستقبلات
الفحص عالي الإنتاجية للدراسات ما قبل السريرية
كيف يعمل؟
مبدأ اختبار الكشف عن معقدات البروتين AlphaLISA SureFire Ultra
يقيس اختبار AlphaLISA SureFire Ultra المركب التفاعلات بين البروتينات الخلوية (PPI).
يستخدم هذا الاختبار نوعين من الأجسام المضادة، أحدهما يتعرف على البروتين 1 والآخر على البروتين 2. تتطلب اختبارات AlphaLISA نوعين من الخرز: خرز المستقبل وخرز المانح. يُغطى خرز المستقبل بعامل CaptSure™ الخاص لتثبيت الجسم المضاد الأول المستخدم في الاختبار، والموسوم بعلامة CaptSure. أما خرز المانح، فيُغطى بالستربتافيدين لالتقاط الجسم المضاد الثاني، وهو مُرتبط بالبيوتين. في وجود مُركب البروتين، يُقرّب الجسمان المضادان خرز المانح والمستقبل من بعضهما، حيث ينقل الأكسجين الأحادي الطاقة لإثارة خرز المستقبل، مما يسمح بتوليد إشارة ألفا مُضيئة. تتناسب كمية الضوء المنبعث طرديًا مع كمية بروتين PPI الموجودة في العينة.

بروتوكول فحص AlphaLISA SureFire Ultra للكشف عن التعقيد باستخدام لوحتين
يتضمن بروتوكول الصفيحتين زراعة الخلايا ومعالجتها في صفيحة ذات 96 بئراً قبل تحللها، ثم نقل المستخلصات إلى صفيحة Optiplate ذات 384 بئراً قبل إضافة كواشف الكشف المعقدة AlphaLISA SureFire Ultra. يتيح هذا البروتوكول مراقبة حيوية الخلايا وكثافتها. إضافةً إلى ذلك، يمكن استخدام المستخلصات من بئر واحد لقياس أهداف متعددة.

بروتوكول فحص AlphaLISA SureFire Ultra للكشف عن معقدات البروتين في لوحة واحدة
يمكن الكشف عن المركب البروتيني باستخدام كواشف AlphaLISA SureFire Ultra في صفيحة واحدة تُستخدم للزراعة والمعالجة والتحليل. لا حاجة لخطوات غسل. يتيح هذا البروتوكول المصمم بتقنية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) تصغير الحجم مع الحفاظ على جودة AlphaLISA SureFire Ultra العالية.
حساسية الفحص
حساسية الفحص - تخفيف مستخلص الخلية
تم تحضير مستخلص الخلايا من خلايا كارباس 299 بتركيز 2 × 10⁶ خلية/مل، وحُفزت باستخدام 10 نانوغرام/مل من إنترلوكين-1 بيتا لمدة 10 دقائق في محلول هانكس المتوازن للأملاح مع 0.1% من ألبومين المصل البقري. ثم حُللت الخلايا بإضافة محلول التحلل 5X لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التحريك.
تم تخفيف المستخلص الخلوي بشكل متسلسل في محلول التحلل، وقُيِّمت مستويات معقد IRAK1/IRAK4 باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من المستخلص الخلوي إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف إليها 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضِّنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضِّنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية.
يُشار إلى العدد التقريبي للخلايا لكل نقطة بيانات. يُمثل الخط المنقط خلفية التحليل. يمكن للتحليل الكشف عن مُركب IRAK1/IRAK4 حتى 500 خلية/نقطة بيانات.
تطبيق - إشارات الخلية
متوافق مع أنظمة التشغيل الآلي - نعم
العلامة التجارية: ألفا ليسا شورفاير ألترا
طريقة الكشف - ألفا
مدة البروتوكول: ساعتان في درجة حرارة الغرفة
حجم العينة - 30 ميكرولتر
شروط الشحن - يتم الشحن في ثلج أزرق
الهدف-IRAK1 / IRAK4
البروتينات الفوسفورية من الفئة المستهدفة
الأنواع المستهدفة - الإنسان
تكنولوجيا ألفا
المجال العلاجي - الالتهاب
حجم الوحدة - 100 نقطة تحليل