مجموعة الكشف عن إجمالي ATR البشري والفأري من Revvity، ALSU-TATR-A500، AlphaLISA، 500 نقطة اختبار

ملخص
يُعدّ بروتين ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3-related) كينازًا بروتينيًا من نوع سيرين/ثريونين، يعمل كمنظم رئيسي لاستجابة تلف الحمض النووي، لا سيما استجابةً لإجهاد التضاعف. يُفعّل ATR بواسطة الحمض النووي أحادي السلسلة المُغطى ببروتين RPA، مما يؤدي إلى فسفرة المؤثرات النهائية، بما في ذلك CHK1 وp53 وH2AX. عند التفعيل، يبدأ ATR نقاط تفتيش دورة الخلية، ويُثبّت شوكات التضاعف المتوقفة، ويُعزز إصلاح الحمض النووي. تُسبب الطفرات الناقصة في ATR متلازمة سيكل، بينما غالبًا ما تُصبح الخلايا السرطانية مُعتمدة على ATR للبقاء على قيد الحياة بسبب ارتفاع إجهاد التضاعف. يجري تطوير مثبطات ATR كعلاجات للسرطان، وقد أظهرت فتكًا تركيبيًا مع فقدان ATM أو طفرات BRCA.
يُعد اختبار AlphaLISA SureFire Ultra Human and Mouse Total ATR اختبارًا مناعيًا ساندويتشيًا للكشف الكمي عن إجمالي ATR في مستخلصات الخلايا، باستخدام تقنية Alpha.
التنسيقات:

تحتوي مجموعة HV (عالية الحجم) على كواشف لتشغيل 100 بئر في تنسيق 96 بئر، باستخدام حجم تفاعل 60 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة الـ 500 نقطة على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 500 بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط العشرة آلاف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 10000 بئر بتنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط الخمسين ألف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 50 ألف بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.

تتوافق مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra مع:

مستخلصات الخلايا والأنسجة
مُعدِّلات الأجسام المضادة
الأجسام المضادة العلاجية البيولوجية

يمكن استخدام مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra للأغراض التالية:

فحوصات الكيناز الخلوي
دراسات تنشيط المستقبلات
الفحص عالي الإنتاجية للدراسات ما قبل السريرية
كيف يعمل؟
مبدأ اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra
يقيس اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra مستوى التعبير عن بروتين مستهدف في مستخلص خلوي.
يستخدم اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra نوعين من الأجسام المضادة التي تتعرف على موقعين مختلفين على البروتين المستهدف. تتطلب اختبارات AlphaLISA نوعين من الخرز: خرز المستقبل وخرز المانح. يُغطى خرز المستقبل بعامل CaptSure™ الخاص لتثبيت الجسم المضاد الخاص بالاختبار، والموسوم بعلامة CaptSure. أما خرز المانح فيُغطى بالستربتافيدين لالتقاط أحد الأجسام المضادة للكشف، وهو مُرتبط بالبيوتين. في وجود البروتين المستهدف، يُقرّب الجسمان المضادان خرز المانح والمستقبل من بعضهما، حيث ينقل الأكسجين الأحادي الطاقة لإثارة خرز المستقبل، مما يسمح بتوليد إشارة ألفا مضيئة. تتناسب كمية الضوء المنبعث طرديًا مع كمية البروتين الموجودة في العينة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra ثنائي الألواح
يتضمن بروتوكول الصفيحتين زراعة الخلايا ومعالجتها في صفيحة ذات 96 بئراً قبل تحللها، ثم نقل المستخلصات إلى صفيحة OptiPlate™ ذات 384 بئراً قبل إضافة كواشف الكشف Total-AlphaLISA SureFire Ultra. يسمح هذا البروتوكول بمراقبة حيوية الخلايا وكثافتها. إضافةً إلى ذلك، يمكن استخدام المستخلصات من بئر واحد لقياس أهداف متعددة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra أحادي اللوحة
يمكن الكشف عن البروتين المستهدف الكلي باستخدام كواشف AlphaLISA SureFire Ultra في صفيحة واحدة تُستخدم للزراعة والمعالجة والتحليل. لا حاجة لخطوات غسل. يتيح هذا البروتوكول المصمم بتقنية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) تصغير حجم العينة مع الحفاظ على جودة AlphaLISA SureFire Ultra.
تنوع التحليل
التعبير عن ATR في مختلف أنواع الخلايا
تمت زراعة الخلايا الملتصقة حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175 في وسط غذائي كامل، ثم تم تحليلها باستخدام محلول التحلل عند كثافة 1 × 10⁶ خلية/مل. تم جمع الخلايا المعلقة، وغسلها بمحلول HBSS، ثم تحليلها باستخدام محلول التحلل عند كثافة 3.2 × 10⁶ خلية/مل.
تم تقييم مستويات ATR الكلية باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلية (10000 خلية ملتصقة و32000 خلية معلقة) إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية. تم الكشف عن تعبير ATR في مجموعة واسعة من خطوط الخلايا البشرية والفأرية.
حساسية الفحص
حساسية اختبار ATR - تخفيف مستخلص الخلية
تم تحضير مستخلص الخلايا من خلايا هيلا التي تم زرعها حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قوارير T175 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون. عولجت كل قارورة بالإيتوبوسيد بتركيز 2 ميكرومتر لمدة 18 ساعة، ثم تم تحليلها في 3 مل من محلول التحلل لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة مع الرج.
تم تخفيف مستخلص الخلايا بشكل متسلسل في محلول التحلل وATR Phospho (Thr1989)، وقُيِّمت المستويات الكلية باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلايا إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضِّنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضِّنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية.
يُشار إلى العدد التقريبي للخلايا لكل نقطة بيانات. يُمثل الخط المنقط خلفية التحليل. يمكن لهذا التحليل الكشف عن تعبير ATR في أقل من 1000 خلية/نقطة بيانات.
تطبيق - إشارات الخلية
متوافق مع أنظمة التشغيل الآلي - نعم
العلامة التجارية: ألفا ليسا شورفاير ألترا
طريقة الكشف - ألفا
مدة البروتوكول: ساعتان في درجة حرارة الغرفة
حجم العينة - 10 ميكرولتر
شروط الشحن - يتم الشحن في ثلج أزرق
الهدف-ATR
البروتينات الفوسفورية من الفئة المستهدفة
الأنواع المستهدفة: الإنسان والفأر
تكنولوجيا ألفا
المجال العلاجي - علم الأورام
حجم الوحدة - 500 نقطة تحليل