مجموعة الكشف عن إجمالي إنزيم BCKDHA البشري من شركة Revvity، طراز ALSU-TBCKD-A10K، AlphaLISA، 10000 نقطة اختبار

ملخص
إنزيم نازع هيدروجين الكيتوأحماض المتفرعة السلسلة E1-ألفا (BCKDHA) هو الوحدة الفرعية المحفزة لمركب BCKDC، الذي يحفز عملية نزع الكربوكسيل غير العكوسة للأحماض الكيتوأحماض المتفرعة السلسلة المشتقة من الليوسين، والإيزوليوسين، والفالين. يمثل BCKDHA الخطوة المحددة لمعدل هدم الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة، ويُعبر عنه بشكل رئيسي في الكبد والعضلات والكلى والدماغ. تسبب الطفرات في BCKDHA مرض بول شراب القيقب (MSUD)، الذي يتميز بتراكم مشتقات الكيتوأحماض السامة مما يؤدي إلى تلف عصبي. تختلف شدة مرض MSUD تبعًا لنشاط الإنزيم المتبقي، بدءًا من الأشكال الكلاسيكية الشديدة وصولًا إلى المتغيرات المتوسطة. وقد ارتبط تغير التعبير عن BCKDHA باستقلاب السرطان، وداء السكري، وأمراض القلب والأوعية الدموية.
يُعد اختبار AlphaLISA SureFire Ultra Human Total BCKDHA اختبارًا مناعيًا ساندويتشيًا للكشف الكمي عن إجمالي BCKDHA في المستخلصات الخلوية، باستخدام تقنية Alpha.
التنسيقات:

تحتوي مجموعة HV (عالية الحجم) على كواشف لتشغيل 100 بئر في تنسيق 96 بئر، باستخدام حجم تفاعل 60 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة الـ 500 نقطة على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 500 بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط العشرة آلاف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 10000 بئر بتنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط الخمسين ألف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 50 ألف بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.

تتوافق مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra مع:

مستخلصات الخلايا والأنسجة
مُعدِّلات الأجسام المضادة
الأجسام المضادة العلاجية البيولوجية

يمكن استخدام مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra للأغراض التالية:

فحوصات الكيناز الخلوي
دراسات تنشيط المستقبلات
الفحص عالي الإنتاجية للدراسات ما قبل السريرية
كيف يعمل؟
مبدأ اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra
يقيس اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra مستوى التعبير عن بروتين مستهدف في مستخلص خلوي.
يستخدم اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra نوعين من الأجسام المضادة التي تتعرف على موقعين مختلفين على البروتين المستهدف. تتطلب اختبارات AlphaLISA نوعين من الخرز: خرز المستقبل وخرز المانح. يُغطى خرز المستقبل بعامل CaptSure™ الخاص لتثبيت الجسم المضاد الخاص بالاختبار، والموسوم بعلامة CaptSure. أما خرز المانح فيُغطى بالستربتافيدين لالتقاط أحد الأجسام المضادة للكشف، وهو مُرتبط بالبيوتين. في وجود البروتين المستهدف، يُقرّب الجسمان المضادان خرز المانح والمستقبل من بعضهما، حيث ينقل الأكسجين الأحادي الطاقة لإثارة خرز المستقبل، مما يسمح بتوليد إشارة ألفا مضيئة. تتناسب كمية الضوء المنبعث طرديًا مع كمية البروتين الموجودة في العينة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra ثنائي الألواح
يتضمن بروتوكول الصفيحتين زراعة الخلايا ومعالجتها في صفيحة ذات 96 بئراً قبل تحللها، ثم نقل المستخلصات إلى صفيحة OptiPlate™ ذات 384 بئراً قبل إضافة كواشف الكشف Total-AlphaLISA SureFire Ultra. يسمح هذا البروتوكول بمراقبة حيوية الخلايا وكثافتها. إضافةً إلى ذلك، يمكن استخدام المستخلصات من بئر واحد لقياس أهداف متعددة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra أحادي اللوحة
يمكن الكشف عن البروتين المستهدف الكلي باستخدام كواشف AlphaLISA SureFire Ultra في صفيحة واحدة تُستخدم للزراعة والمعالجة والتحليل. لا حاجة لخطوات غسل. يتيح هذا البروتوكول المصمم بتقنية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) تصغير حجم العينة مع الحفاظ على جودة AlphaLISA SureFire Ultra.
تنوع التحليل
التعبير عن BCKDHA في مختلف أنواع الخلايا
تمت زراعة الخلايا الملتصقة حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون، ثم تم تحليلها باستخدام محلول التحلل عند كثافة 0.25 × 10⁶ خلية/مل. تم غسل الخلايا المعلقة بمحلول HBSS ثم تحليلها باستخدام محلول التحلل عند كثافة 0.8 × 10⁶ خلية/مل.
تم تقييم مستويات BCKDHA باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلية (2500 خلية ملتصقة أو 8000 خلية معلقة) إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية.
تم الكشف عن تعبير جين BCKDHA في مجموعة واسعة من خطوط الخلايا البشرية.
حساسية الفحص
حساسية اختبار BCKDHA - تخفيف مستخلص الخلية
تم تحضير مستخلص الخلايا من خلايا HeLa التي تمت زراعتها حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175 وتم تحليلها في 4 مل من محلول التحلل.
تم تخفيف مستخلص الخلايا بشكل متسلسل في محلول التحلل، وقُيِّمت مستويات BCKDHA Phospho (Ser292) والمستويات الكلية باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلايا إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضِّنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضِّنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية.
يُشار إلى العدد التقريبي للخلايا. يُمثل الخط المنقط خلفية التحليل. يتميز تحليل BCKDHA بنطاق ديناميكي واسع، ويمكنه الكشف عن تعبير BCKDHA في أقل من 50 خلية/نقطة بيانات.
تطبيق - إشارات الخلية
متوافق مع أنظمة التشغيل الآلي - نعم
العلامة التجارية: ألفا ليسا شورفاير ألترا
طريقة الكشف - ألفا
مدة البروتوكول: ساعتان في درجة حرارة الغرفة
حجم العينة - 10 ميكرولتر
شروط الشحن - يتم الشحن في ثلج أزرق
الهدف-BCKDHA
البروتينات الفوسفورية من الفئة المستهدفة
الأنواع المستهدفة - الإنسان
تكنولوجيا ألفا
المجال العلاجي: علم الأعصاب الأيضي والأورام
حجم الوحدة - 10000 نقطة تحليل