مجموعة الكشف عن بروتين B-Raf البشري الكلي ألفاليسا V600E من ريفيتي، ALSU-TBRAF-B-HV، 100 نقطة اختبار

ملخص
يُعدّ B-Raf كيناز بروتين سيرين/ثريونين، وهو أحد أفراد عائلة RAF، ويؤدي دورًا محوريًا في سلسلة إشارات RAS-RAF-MEK-ERK. يتم تنشيط B-Raf عن طريق ارتباط RAS-GTP، مما يُعزز عملية التضاعف وتنشيط الكيناز، مُؤديًا إلى فسفرة MEK1/2. تُؤدي طفرة V600E في B-Raf، الموجودة في حوالي 50% من حالات سرطان الجلد الميلانيني، إلى نشاط كينازي مُستمر وتحوّل سرطاني. في المقابل، يُمكن لطفرات أخرى في B-Raf أن تُنشّط RAF من النوع البري من خلال تعزيز عملية التضاعف. وقد أحدثت مثبطات B-Raf المُستهدفة، مثل فيمورافينيب ودابرافينيب، ثورة في علاج سرطان الجلد الميلانيني الحامل لطفرة B-Raf V600E.
يُعد اختبار AlphaLISA SureFire Ultra Human Total B-Raf V600E اختبارًا مناعيًا ساندويتشيًا للكشف الكمي عن إجمالي B-Raf V600E في مستخلصات الخلايا، باستخدام تقنية Alpha.
التنسيقات:

تحتوي مجموعة HV (عالية الحجم) على كواشف لتشغيل 100 بئر بتنسيق 96 بئر، باستخدام حجم تفاعل 60 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة الـ 500 نقطة على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 500 بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط العشرة آلاف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 10000 بئر بتنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط الخمسين ألف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 50 ألف بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.

تتوافق مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra مع:

مستخلصات الخلايا والأنسجة
مُعدِّلات الأجسام المضادة
الأجسام المضادة العلاجية البيولوجية

يمكن استخدام مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra للأغراض التالية:

فحوصات الكيناز الخلوي
دراسات تنشيط المستقبلات
الفحص عالي الإنتاجية للدراسات ما قبل السريرية
كيف يعمل؟
مبدأ اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra
يقيس اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra مستوى التعبير عن بروتين مستهدف في مستخلص خلوي.
يستخدم اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra نوعين من الأجسام المضادة التي تتعرف على موقعين مختلفين على البروتين المستهدف. تتطلب اختبارات AlphaLISA نوعين من الخرز: خرز المستقبل وخرز المانح. يُغطى خرز المستقبل بعامل CaptSure™ الخاص لتثبيت الجسم المضاد الخاص بالاختبار، والموسوم بعلامة CaptSure. أما خرز المانح فيُغطى بالستربتافيدين لالتقاط أحد الأجسام المضادة للكشف، وهو مُرتبط بالبيوتين. في وجود البروتين المستهدف، يُقرّب الجسمان المضادان خرز المانح والمستقبل من بعضهما، حيث ينقل الأكسجين الأحادي الطاقة لإثارة خرز المستقبل، مما يسمح بتوليد إشارة ألفا مضيئة. تتناسب كمية الضوء المنبعث طرديًا مع كمية البروتين الموجودة في العينة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra ثنائي الألواح
يتضمن بروتوكول الصفيحتين زراعة الخلايا ومعالجتها في صفيحة ذات 96 بئراً قبل تحللها، ثم نقل المستخلصات إلى صفيحة OptiPlate™ ذات 384 بئراً قبل إضافة كواشف الكشف Total-AlphaLISA SureFire Ultra. يسمح هذا البروتوكول بمراقبة حيوية الخلايا وكثافتها. إضافةً إلى ذلك، يمكن استخدام المستخلصات من بئر واحد لقياس أهداف متعددة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra أحادي اللوحة
يمكن الكشف عن البروتين المستهدف الكلي باستخدام كواشف AlphaLISA SureFire Ultra في صفيحة واحدة تُستخدم للزراعة والمعالجة والتحليل. لا حاجة لخطوات غسل. يتيح هذا البروتوكول المصمم بتقنية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) تصغير حجم العينة مع الحفاظ على جودة AlphaLISA SureFire Ultra.
تنوع التحليل
التعبير التفاضلي بين طفرة B-Raf والنمط البري
تمت زراعة الخلايا الملتصقة حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قوارير T175 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون، وتم تحليلها باستخدام محلول التحلل عند كثافة 0.5 × 106 خلية/مل.
تم تقييم مستويات B-Raf V600E وB-Raf Total باستخدام اختبارات AlphaLISA SureFire Ultra الخاصة بكل منهما. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلية إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة على جهاز Envision باستخدام إعدادات AlphaLISA القياسية.
لا يُرصد بروتين B-Raf V600E إلا في سلالات الخلايا السرطانية التي تحمل هذه الطفرة، أي خلايا A375 وSK-MEL-28 وHT 29. وكما هو متوقع، لم يُرصد أي تعبير عن بروتين B-Raf V600E في سلالات الخلايا التي تُعبر عن بروتين B-Raf WT، مثل SW 48.
حساسية الفحص
حساسية الفحص - مستخلص الخلية
تم تحضير مستخلص الخلايا من خلايا A375 التي تمت زراعتها حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175 وتم تحليلها في 6 مل من محلول التحلل.
تم تخفيف المستخلص الخلوي بشكل متسلسل في محلول التحلل، وقُيِّمت مستويات B-Raf V600E باستخدام مجموعة AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من المستخلص الخلوي إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف إليها 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة على جهاز Envision باستخدام إعدادات AlphaLISA القياسية.
يُشار إلى العدد التقريبي للخلايا/نقطة البيانات على الرسم البياني. يُمثل الخط المنقط خلفية التحليل. يستطيع التحليل الكشف عن بروتين B-Raf B600E حتى 400 خلية تقريبًا.
تطبيق - إشارات الخلية
متوافق مع أنظمة التشغيل الآلي - نعم
العلامة التجارية: ألفا ليسا شورفاير ألترا
طريقة الكشف - ألفا
مدة البروتوكول: ساعتان في درجة حرارة الغرفة
حجم العينة - 30 ميكرولتر
شروط الشحن - يتم الشحن في ثلج أزرق
الهدف-ب-راف
البروتينات الفوسفورية من الفئة المستهدفة
الأنواع المستهدفة - الإنسان
تكنولوجيا ألفا
المجال العلاجي - علم الأورام
حجم الوحدة - 100 نقطة تحليل