مجموعة الكشف عن HIF2α البشري الكلي من Revvity، ALSU-THIF-A50K، AlphaLISA، 50000 نقطة اختبار

ملخص
يُعدّ عامل تحفيز نقص الأكسجين 2-ألفا (HIF2α) عامل نسخ حساس للأكسجين، يُنظّم تكيف الخلايا مع نقص الأكسجين من خلال التحكم في الجينات المشاركة في تكوين الأوعية الدموية، وتكوين خلايا الدم الحمراء، والتمثيل الغذائي. في ظل الظروف الطبيعية للأكسجين، يخضع HIF2α لعملية الهيدروكسيل بواسطة إنزيمات بروليل هيدروكسيلاز، مما يؤدي إلى تحلله بوساطة VHL. أثناء نقص الأكسجين، يستقر HIF2α ويتحد مع HIF1β ليرتبط بعناصر الاستجابة لنقص الأكسجين في محفزات الجينات المستهدفة. يُنظّم HIF2α بشكل فريد الإريثروبويتين، وVEGF في الخلايا البطانية، والجينات المشاركة في استقلاب الدهون. تُسبب الطفرات في VHL أو HIF2α كثرة الحمر وسرطان الخلايا الكلوية الصافية، حيث يُحفّز نشاط HIF2α المستمر نمو الورم. وقد أظهرت مثبطات HIF2α النوعية، مثل بيلزوتيفان، فعالية ملحوظة في علاج سرطان الخلايا الكلوية الصافية.
يُعد اختبار AlphaLISA SureFire Ultra Human Total HIF2α اختبارًا مناعيًا ساندويتشيًا للكشف الكمي عن HIF2α الكلي في المستخلصات الخلوية، باستخدام تقنية Alpha.
التنسيقات:

تحتوي مجموعة HV (عالية الحجم) على كواشف لتشغيل 100 بئر في تنسيق 96 بئر، باستخدام حجم تفاعل 60 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة الـ 500 نقطة على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 500 بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط العشرة آلاف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 10000 بئر بتنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط الخمسين ألف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 50 ألف بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.

تتوافق مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra مع:

مستخلصات الخلايا والأنسجة
مُعدِّلات الأجسام المضادة
الأجسام المضادة العلاجية البيولوجية

يمكن استخدام مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra للأغراض التالية:

فحوصات الكيناز الخلوي
دراسات تنشيط المستقبلات
الفحص عالي الإنتاجية للدراسات ما قبل السريرية
كيف يعمل؟
مبدأ اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra
يقيس اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra مستوى التعبير عن بروتين مستهدف في مستخلص خلوي.
يستخدم اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra نوعين من الأجسام المضادة التي تتعرف على موقعين مختلفين على البروتين المستهدف. تتطلب اختبارات AlphaLISA نوعين من الخرز: خرز المستقبل وخرز المانح. يُغطى خرز المستقبل بعامل CaptSure™ الخاص لتثبيت الجسم المضاد الخاص بالاختبار، والموسوم بعلامة CaptSure. أما خرز المانح فيُغطى بالستربتافيدين لالتقاط أحد الأجسام المضادة للكشف، وهو مُرتبط بالبيوتين. في وجود البروتين المستهدف، يُقرّب الجسمان المضادان خرز المانح والمستقبل من بعضهما، حيث ينقل الأكسجين الأحادي الطاقة لإثارة خرز المستقبل، مما يسمح بتوليد إشارة ألفا مضيئة. تتناسب كمية الضوء المنبعث طرديًا مع كمية البروتين الموجودة في العينة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra ثنائي الألواح
يتضمن بروتوكول الصفيحتين زراعة الخلايا ومعالجتها في صفيحة ذات 96 بئراً قبل تحللها، ثم نقل المستخلصات إلى صفيحة OptiPlate™ ذات 384 بئراً قبل إضافة كواشف الكشف Total-AlphaLISA SureFire Ultra. يسمح هذا البروتوكول بمراقبة حيوية الخلايا وكثافتها. إضافةً إلى ذلك، يمكن استخدام المستخلصات من بئر واحد لقياس أهداف متعددة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra أحادي اللوحة
يمكن الكشف عن البروتين المستهدف الكلي باستخدام كواشف AlphaLISA SureFire Ultra في صفيحة واحدة تُستخدم للزراعة والمعالجة والتحليل. لا حاجة لخطوات غسل. يتيح هذا البروتوكول المصمم بتقنية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) تصغير حجم العينة مع الحفاظ على جودة AlphaLISA SureFire Ultra.
تنوع التحليل
التعبير عن HIF-2α في مختلف أنواع الخلايا
تم زرع الخلايا الملتصقة بمعدل 40000 خلية/بئر في صفيحة زراعة مكونة من 96 بئراً في وسط كامل وحُضنت طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون. عولجت الخلايا بـ CoCl2 لمدة 4 ساعات، ثم غُسلت بمحلول HBSS وحُللت باستخدام 100 ميكرولتر من محلول التحلل.
تم تقييم مستويات HIF-2α الكلية باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلية (حوالي 4000 خلية) إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية.
حساسية الفحص
حساسية الفحص - مستخلص الخلية
تم تحضير مستخلص الخلايا من خلايا HEK293 التي تم زرعها حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175، ثم تم تحفيزها باستخدام 250 ميكرومول من كلوريد الكوبالت لمدة 18 ساعة. تم تحليل الخلايا باستخدام محلول التحلل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التحريك.
تم تخفيف المستخلص الخلوي بشكل متسلسل في محلول التحلل، وقُيِّمت مستويات HIF-2α الكلية باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من المستخلص الخلوي إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف إليها 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية.
يُشار إلى العدد التقريبي للخلايا لكل نقطة بيانات. يُمثل الخط المنقط خلفية التحليل. يمكن للتحليل الكشف عن إجمالي HIF-2α حتى 500 خلية/نقطة بيانات.
تطبيق - إشارات الخلية
متوافق مع أنظمة التشغيل الآلي - نعم
العلامة التجارية: ألفا ليسا شورفاير ألترا
طريقة الكشف - ألفا
مدة البروتوكول: ساعتان في درجة حرارة الغرفة
حجم العينة - 10 ميكرولتر
شروط الشحن - يتم الشحن في ثلج أزرق
الهدف-HIF2α
البروتينات الفوسفورية من الفئة المستهدفة
الأنواع المستهدفة - الإنسان
تكنولوجيا ألفا
المجال العلاجي - الالتهاب
حجم الوحدة: 50,000 نقطة تحليل