Revvity، ALSU-TMFN2-A10K، مجموعة الكشف عن الميتوفوسين 2 الكلي البشري والفأري AlphaLISA، 10000 نقطة اختبار

ملخص
الميتوفوزينات (MFN1 وMFN2) هي بروتينات GTPases مرتبطة بالدينامين، تقع في الغشاء الخارجي للميتوكوندريا، وتتوسط عملية اندماج الميتوكوندريا، وهو أمر ضروري للحفاظ على شكلها ووظيفتها. تعمل الميتوفوزينات كروابط جزيئية تربط الميتوكوندريا المتجاورة، حيث يحفز تحلل GTP اندماج الأغشية. يتميز MFN1 بنشاط اندماجي أعلى، بينما يؤدي MFN2 أدوارًا إضافية في ربط الشبكة الإندوبلازمية بالميتوكوندريا. تسبب الطفرات في MFN2 مرض شاركو-ماري-توث من النوع 2A، وهو اعتلال عصبي محيطي ناتج عن خلل في ديناميكية الميتوكوندريا. يرتبط خلل وظيفة الميتوفوزين بأمراض التمثيل الغذائي، والاضطرابات التنكسية العصبية، والسرطان.
يُعد اختبار AlphaLISA SureFire Ultra Human and Mouse Total Mitofusin 2 اختبارًا مناعيًا ساندويتشيًا للكشف الكمي عن إجمالي Mitofusin 2 في مستخلصات الخلايا، باستخدام تقنية Alpha.
التنسيقات:

تحتوي مجموعة HV (عالية الحجم) على كواشف لتشغيل 100 بئر في تنسيق 96 بئر، باستخدام حجم تفاعل 60 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة الـ 500 نقطة على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 500 بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط العشرة آلاف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 10000 بئر بتنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط الخمسين ألف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 50 ألف بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.

تتوافق مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra مع:

مستخلصات الخلايا والأنسجة
مُعدِّلات الأجسام المضادة
الأجسام المضادة العلاجية البيولوجية

يمكن استخدام مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra للأغراض التالية:

فحوصات الكيناز الخلوي
دراسات تنشيط المستقبلات
الفحص عالي الإنتاجية للدراسات ما قبل السريرية
كيف يعمل؟
مبدأ اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra
يقيس اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra مستوى التعبير عن بروتين مستهدف في مستخلص خلوي.
يستخدم اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra نوعين من الأجسام المضادة التي تتعرف على موقعين مختلفين على البروتين المستهدف. تتطلب اختبارات AlphaLISA نوعين من الخرز: خرز المستقبل وخرز المانح. يُغطى خرز المستقبل بعامل CaptSure™ الخاص لتثبيت الجسم المضاد الخاص بالاختبار، والموسوم بعلامة CaptSure. أما خرز المانح فيُغطى بالستربتافيدين لالتقاط أحد الأجسام المضادة للكشف، وهو مُرتبط بالبيوتين. في وجود البروتين المستهدف، يُقرّب الجسمان المضادان خرز المانح والمستقبل من بعضهما، حيث ينقل الأكسجين الأحادي الطاقة لإثارة خرز المستقبل، مما يسمح بتوليد إشارة ألفا مضيئة. تتناسب كمية الضوء المنبعث طرديًا مع كمية البروتين الموجودة في العينة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra ثنائي الألواح
يتضمن بروتوكول الصفيحتين زراعة الخلايا ومعالجتها في صفيحة ذات 96 بئراً قبل تحللها، ثم نقل المستخلصات إلى صفيحة OptiPlate™ ذات 384 بئراً قبل إضافة كواشف الكشف Total-AlphaLISA SureFire Ultra. يسمح هذا البروتوكول بمراقبة حيوية الخلايا وكثافتها. إضافةً إلى ذلك، يمكن استخدام المستخلصات من بئر واحد لقياس أهداف متعددة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra أحادي اللوحة
يمكن الكشف عن البروتين المستهدف الكلي باستخدام كواشف AlphaLISA SureFire Ultra في صفيحة واحدة تُستخدم للزراعة والمعالجة والتحليل. لا حاجة لخطوات غسل. يتيح هذا البروتوكول المصمم بتقنية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) تصغير حجم العينة مع الحفاظ على جودة AlphaLISA SureFire Ultra.
تنوع التحليل
التعبير عن بروتين ميتوفوسين 2 في مختلف أنواع الخلايا
تمت زراعة الخلايا الملتصقة حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون، وتم تحليلها باستخدام محلول التحلل عند كثافة 0.5 × 106 خلية/مل.
تم تقييم مستويات ميتوفوسين 2 باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلية (5000 خلية) إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية.
تم الكشف عن تعبير بروتين ميتوفوسين 2 في مجموعة واسعة من خطوط الخلايا البشرية والفأرية
حساسية الفحص
حساسية اختبار ميتوفوسين 2

عُزلت الخلايا الليمفاوية أحادية النواة من متبرعين أصحاء، ثم حُللت باستخدام محلول التحلل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج (350 دورة في الدقيقة). خُففت المحاليل بشكل متسلسل في محلول التحلل، ثم قُيمت مستويات ميتوفوسين 2 باستخدام جهاز AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من محلول الخلية (يُشار إلى العدد التقريبي للخلايا) إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أخيرًا، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المتبرع إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة على جهاز Envision باستخدام إعدادات AlphaLISA القياسية.
تم الكشف عن تعبير Mitofusin 2 في الخلايا الليمفاوية المحيطية أحادية النواة في أقل من 500 خلية/نقطة بيانات.

تم تحضير مستخلص الخلايا من خلايا HeLa التي تمت زراعتها حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175 وتم تحليلها في 8 مل من محلول التحلل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج.
تم تخفيف مستخلص الخلايا بشكل متسلسل في محلول التحلل، وقُيِّمت مستويات ميتوفوسين 2 باستخدام جهاز AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلايا إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف إليها 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية.
يُشار إلى العدد التقريبي للخلايا. يُمثل الخط المنقط خلفية التحليل. يتميز تحليل ميتوفوسين 2 بنطاق ديناميكي واسع، ويمكنه الكشف عن تعبير ميتوفوسين 2 في أقل من 100 خلية/نقطة بيانات.
تطبيق - إشارات الخلية
متوافق مع أنظمة التشغيل الآلي - نعم
العلامة التجارية: ألفا ليسا شورفاير ألترا
طريقة الكشف - ألفا
مدة البروتوكول: ساعتان في درجة حرارة الغرفة
حجم العينة - 10 ميكرولتر
شروط الشحن - يتم الشحن في ثلج أزرق
الهدف-ميتوفوسين 2
البروتينات الفوسفورية من الفئة المستهدفة
الأنواع المستهدفة: الإنسان والفأر
تكنولوجيا ألفا
المجال العلاجي: علم الأعصاب الأيضي والأورام
حجم الوحدة - 10000 نقطة تحليل