Revvity، ALSU-TNECT4-A50K، مجموعة الكشف عن النكتين-4 البشري الكلي AlphaLISA، 50000 نقطة اختبار

ملخص
يُعدّ نكتين-4 (PVRL4) جزيئًا للالتصاق الخلوي يُنظّم الروابط بين الخلايا، وبنية الأنسجة، وتطور الأورام. يتوسط نكتين-4 التفاعلات المتجانسة وغير المتجانسة، مما يُساهم في تكوين الوصلات اللاصقة واستقطاب الخلايا الظهارية. يُظهر تعبيرًا محدودًا في أنسجة البالغين الطبيعية، ولكنه يُصبح مُفرط التعبير في العديد من سرطانات الظهارة، بما في ذلك سرطانات الظهارة البولية، والثدي، والرئة. يُؤهل التعبير المحدود في الأنسجة الطبيعية نكتين-4 ليكون هدفًا جذابًا للأجسام المضادة المُقترنة بالأدوية. وقد أظهر إنفورتوماب فيدوتين، وهو جسم مضاد مُقترن بالأدوية يستهدف نكتين-4، فعالية كبيرة في علاج سرطان الظهارة البولية المُتقدم، مما يُؤكد أن نكتين-4 هدف علاجي مُعتمد.
يُعد اختبار AlphaLISA SureFire Ultra Human Total Nectin-4 اختبارًا مناعيًا ساندويتشيًا للكشف الكمي عن Nectin-4 الكلي في مستخلصات الخلايا، باستخدام تقنية Alpha.
التنسيقات:

تحتوي مجموعة HV (عالية الحجم) على كواشف لتشغيل 100 بئر في تنسيق 96 بئر، باستخدام حجم تفاعل 60 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة الـ 500 نقطة على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 500 بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط العشرة آلاف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 10000 بئر بتنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط الخمسين ألف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 50 ألف بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.

تتوافق مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra مع:

مستخلصات الخلايا والأنسجة
مُعدِّلات الأجسام المضادة
الأجسام المضادة العلاجية البيولوجية

يمكن استخدام مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra للأغراض التالية:

فحوصات الكيناز الخلوي
دراسات تنشيط المستقبلات
الفحص عالي الإنتاجية للدراسات ما قبل السريرية
كيف يعمل؟
مبدأ اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra
يقيس اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra مستوى التعبير عن بروتين مستهدف في مستخلص خلوي.
يستخدم اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra نوعين من الأجسام المضادة التي تتعرف على موقعين مختلفين على البروتين المستهدف. تتطلب اختبارات AlphaLISA نوعين من الخرز: خرز المستقبل وخرز المانح. يُغطى خرز المستقبل بعامل CaptSure™ الخاص لتثبيت الجسم المضاد الخاص بالاختبار، والموسوم بعلامة CaptSure. أما خرز المانح فيُغطى بالستربتافيدين لالتقاط أحد الأجسام المضادة للكشف، وهو مُرتبط بالبيوتين. في وجود البروتين المستهدف، يُقرّب الجسمان المضادان خرز المانح والمستقبل من بعضهما، حيث ينقل الأكسجين الأحادي الطاقة لإثارة خرز المستقبل، مما يسمح بتوليد إشارة ألفا مضيئة. تتناسب كمية الضوء المنبعث طرديًا مع كمية البروتين الموجودة في العينة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra ثنائي الألواح
يتضمن بروتوكول الصفيحتين زراعة الخلايا ومعالجتها في صفيحة ذات 96 بئراً قبل تحللها، ثم نقل المستخلصات إلى صفيحة OptiPlate™ ذات 384 بئراً قبل إضافة كواشف الكشف Total-AlphaLISA SureFire Ultra. يسمح هذا البروتوكول بمراقبة حيوية الخلايا وكثافتها. إضافةً إلى ذلك، يمكن استخدام المستخلصات من بئر واحد لقياس أهداف متعددة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra أحادي اللوحة
يمكن الكشف عن البروتين المستهدف الكلي باستخدام كواشف AlphaLISA SureFire Ultra في صفيحة واحدة تُستخدم للزراعة والمعالجة والتحليل. لا حاجة لخطوات غسل. يتيح هذا البروتوكول المصمم بتقنية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) تصغير حجم العينة مع الحفاظ على جودة AlphaLISA SureFire Ultra.
تنوع التحليل
التعبير عن نكتين-4 في مختلف أنواع الخلايا
تم زرع الخلايا بمعدل 40000 خلية/بئر في صفيحة زراعة مكونة من 96 بئراً في وسط كامل وتم تحضينها طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون، وتم تحليلها باستخدام 100 ميكرولتر من محلول التحلل.
تم تقييم مستويات نكتين-4 باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلية (4000 خلية) إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية.

تنظيم إفراز النكتين-4
تم زرع خلايا A431 في صفيحة ذات 96 بئراً (40000 خلية/بئر) في وسط كامل وحُضنت طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون. وُضعت الخلايا في وسط DMEM طازج ثم تُركت بدون معالجة أو عولجت بـ 5 نانومتر من PMA -/+ 25 ميكرومتر من GW280264X لمدة 24 ساعة.
تم جمع السائل الطافي للخلايا وتقييم مستويات نكتين-4 باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من السائل الطافي إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة على جهاز Envision باستخدام إعدادات AlphaLISA القياسية.
كما هو متوقع، يحفز PMA إطلاق Nectin-4 في السائل الطافي، ويتم تثبيط ذلك بواسطة مثبط الميتالوبروتياز GW280264X.
حساسية الفحص
حساسية اختبار نكتين-4

تم تقييم حساسية اختبار Nectin-4 الكلي من خلال تقييم بروتين Nectin-4 المؤتلف.
تم تحضير تخفيفات من بروتين نكتين-4 المؤتلف (Abcam ab307789) في محلول التحلل، وتم تقييمها باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من البروتين إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة على جهاز Envision باستخدام إعدادات AlphaLISA القياسية.

تم تحضير مستخلص الخلايا من خلايا A431 التي تمت زراعتها حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175 وتم تحليلها في 4 مل من محلول التحلل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج.
تم تخفيف مستخلص الخلايا بشكل متسلسل في محلول التحلل، وقُيِّمت مستويات نكتين-4 باستخدام جهاز AlphaLISA SureFire Ultra. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلايا إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف إليها 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية.
يُشار إلى العدد التقريبي للخلايا. يُمثل الخط المنقط خلفية التحليل. يمكن لتحليل نكتين-4 الكشف عن تعبير نكتين-4 في أقل من 1000 خلية/نقطة بيانات.
تطبيق - إشارات الخلية
متوافق مع أنظمة التشغيل الآلي - نعم
العلامة التجارية: ألفا ليسا شورفاير ألترا
طريقة الكشف - ألفا
مدة البروتوكول: ساعتان في درجة حرارة الغرفة
حجم العينة - 10 ميكرولتر
شروط الشحن - يتم الشحن في ثلج أزرق
الهدف-نيكتين-4
البروتينات الفوسفورية من الفئة المستهدفة
الأنواع المستهدفة - الإنسان
تكنولوجيا ألفا
المجال العلاجي - علم الأورام
حجم الوحدة: 50,000 نقطة تحليل