مجموعة الكشف عن SMAD3 الكلية عالية التخصص للإنسان والفأر من Revvity، ALSU-TSM3-B500، AlphaLISA، 500 نقطة اختبار

ملخص
SMAD3 هو ناقل إشارة وعامل نسخ داخل خلوي، يتوسط إشارات TGF-β والأكتيفين لتنظيم نمو الخلايا وتمايزها وإنتاج المادة الخلوية خارج الخلية. عند تنشيط مستقبل TGF-β، يُفسفر SMAD3، مما يُتيح تكوين مُركبات مع SMAD4 تنتقل إلى النواة. يُنظم مُركب SMAD3/SMAD4 نسخ جينات تشمل الكولاجينات والفيبرونيكتين ومثبطات كينازات السيكلين المعتمدة. يلعب SMAD3 أدوارًا مُرتبطة بالسياق، فهو يعمل كمثبط ومُحفز للأورام. يُساهم فقدان SMAD3 في الإصابة بسرطان القولون والمستقيم، بينما يُؤدي التنشيط المُفرط لـ SMAD3 إلى تليف مرضي في أعضاء مُتعددة.
يُعد اختبار AlphaLISA SureFire Ultra Human and Mouse High Specificity Total SMAD3 اختبارًا مناعيًا ساندويتشيًا للكشف الكمي عن إجمالي SMAD3 في المستخلصات الخلوية، باستخدام تقنية Alpha.
التنسيقات:

تحتوي مجموعة HV (عالية الحجم) على كواشف لتشغيل 100 بئر بتنسيق 96 بئر، باستخدام حجم تفاعل 60 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة الـ 500 نقطة على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 500 بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط العشرة آلاف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 10000 بئر بتنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط الخمسين ألف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 50 ألف بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.

تتوافق مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra مع:

مستخلصات الخلايا والأنسجة
مُعدِّلات الأجسام المضادة
الأجسام المضادة العلاجية البيولوجية

يمكن استخدام مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra للأغراض التالية:

فحوصات الكيناز الخلوي
دراسات تنشيط المستقبلات
الفحص عالي الإنتاجية للدراسات ما قبل السريرية
كيف يعمل؟
مبدأ اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra
يقيس اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra مستوى التعبير عن بروتين مستهدف في مستخلص خلوي.
يستخدم اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra نوعين من الأجسام المضادة التي تتعرف على موقعين مختلفين على البروتين المستهدف. تتطلب اختبارات AlphaLISA نوعين من الخرز: خرز المستقبل وخرز المانح. يُغطى خرز المستقبل بعامل CaptSure™ الخاص لتثبيت الجسم المضاد الخاص بالاختبار، والموسوم بعلامة CaptSure. أما خرز المانح فيُغطى بالستربتافيدين لالتقاط أحد الأجسام المضادة للكشف، وهو مُرتبط بالبيوتين. في وجود البروتين المستهدف، يُقرّب الجسمان المضادان خرز المانح والمستقبل من بعضهما، حيث ينقل الأكسجين الأحادي الطاقة لإثارة خرز المستقبل، مما يسمح بتوليد إشارة ألفا مضيئة. تتناسب كمية الضوء المنبعث طرديًا مع كمية البروتين الموجودة في العينة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra ثنائي الألواح
يتضمن بروتوكول الصفيحتين زراعة الخلايا ومعالجتها في صفيحة ذات 96 بئراً قبل تحللها، ثم نقل المستخلصات إلى صفيحة OptiPlate™ ذات 384 بئراً قبل إضافة كواشف الكشف Total-AlphaLISA SureFire Ultra. يسمح هذا البروتوكول بمراقبة حيوية الخلايا وكثافتها. إضافةً إلى ذلك، يمكن استخدام المستخلصات من بئر واحد لقياس أهداف متعددة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra أحادي اللوحة
يمكن الكشف عن البروتين المستهدف الكلي باستخدام كواشف AlphaLISA SureFire Ultra في صفيحة واحدة تُستخدم للزراعة والمعالجة والتحليل. لا حاجة لخطوات غسل. يتيح هذا البروتوكول المصمم بتقنية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) تصغير حجم العينة مع الحفاظ على جودة AlphaLISA SureFire Ultra.
تنوع التحليل
تعدد استخدامات اختبار SMAD3 Total (HS) في مختلف أنواع الخلايا
تمت زراعة الخلايا الملتصقة حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون، ثم تم تحليلها باستخدام محلول التحلل عند كثافة 1 × 10⁶ خلية/مل. تم جمع الخلايا المعلقة وغسلها بمحلول HBSS ثم تحليلها باستخدام محلول التحلل عند كثافة 3.2 × 10⁶ خلية/مل.
تم تقييم مستويات SMAD3 الكلية باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire فائق الدقة. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلية (10000 خلية ملتصقة و32000 خلية معلقة) إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة على جهاز Envision باستخدام إعدادات AlphaLISA القياسية.
تم الكشف عن التعبير الكلي لـ SMAD3 في مجموعة واسعة من خطوط الخلايا البشرية والفأرية.
حساسية الفحص
حساسية الفحص - مستخلص الخلية
تم تحضير مستخلص الخلايا من خلايا RAW 264.7 التي تم زرعها حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175، ثم تم تحفيزها بـ 50 نانوغرام/مل من TGF-β لمدة 90 دقيقة. تم تحليل الخلايا باستخدام 6 مل من محلول التحليل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التحريك.
تم تخفيف المستخلص الخلوي بشكل متسلسل في محلول التحلل، وقُيِّمت مستويات SMAD3 Phospho (Ser423/425) والمستويات الكلية باستخدام فحوصات AlphaLISA SureFire فائقة التخصص. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من المستخلص الخلوي إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضِّنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضِّنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة على جهاز Envision باستخدام إعدادات AlphaLISA القياسية.
يُشار إلى العدد التقريبي للخلايا لكل نقطة بيانات. يُمثل الخط المنقط خلفية التحليل. يمكن للتحليل الكشف عن SMAD3 Total حتى 2500 خلية/نقطة بيانات.
تطبيق - إشارات الخلية
متوافق مع أنظمة التشغيل الآلي - نعم
العلامة التجارية: ألفا ليسا شورفاير ألترا
طريقة الكشف - ألفا
مدة البروتوكول: ساعتان في درجة حرارة الغرفة
حجم العينة - 10 ميكرولتر
شروط الشحن - يتم الشحن في ثلج أزرق
الهدف-SMAD3
البروتينات الفوسفورية من الفئة المستهدفة
الأنواع المستهدفة: الإنسان والفأر
تكنولوجيا ألفا
المجال العلاجي: الالتهاب، التهاب الكبد الدهني غير الكحولي/التليف، الأورام
حجم الوحدة - 500 نقطة تحليل