مجموعة Revvity، ALSU-TST3-B50K، AlphaLISA عالية الأداء للكشف عن STAT3 الكلي في الإنسان والفأر، 50000 نقطة اختبار

ملخص
يُعدّ مُحَوِّل الإشارة ومُنشِّط النسخ 3 (STAT3) عامل نسخ يُوَسِّط الاستجابات الخلوية للسيتوكينات وعوامل النمو، وينظم الجينات المُشاركة في التكاثر والبقاء والاستجابات المناعية. يتم تنشيط STAT3 عن طريق الفسفرة عند Tyr705، مما يؤدي إلى تكوين ثنائيات، وانتقال نووي، وارتباط بالحمض النووي. ينظم STAT3 التعبير عن جينات تشمل c-MYC، وcyclin D1، وBCL-XL، وVEGF، مما يُعزز تقدم دورة الخلية وبقائها. يُلاحظ التنشيط المُستمر لـ STAT3 في حوالي 70% من الأورام، حيث يُحفز تكوّن الأورام ويُهيئ بيئة دقيقة مُثبِّطة للمناعة. يجري تطوير مُثبِّطات STAT3 كعلاجات للسرطان لاستهداف الخلايا السرطانية واستعادة المناعة المُضادة للأورام.
يُعد اختبار AlphaLISA SureFire Ultra High Performance Human and Mouse Total STAT3 اختبارًا مناعيًا ساندويتشيًا للكشف الكمي عن إجمالي STAT3 في المستخلصات الخلوية، باستخدام تقنية Alpha.
التنسيقات:

تحتوي مجموعة HV (عالية الحجم) على كواشف لتشغيل 100 بئر بتنسيق 96 بئر، باستخدام حجم تفاعل 60 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة الـ 500 نقطة على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 500 بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط العشرة آلاف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 10000 بئر بتنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.
تحتوي مجموعة النقاط الخمسين ألف على ما يكفي من الكواشف لتشغيل 50 ألف بئر في تنسيق 384 بئر، باستخدام حجم تفاعل 20 ميكرولتر.

تتوافق مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra مع:

مستخلصات الخلايا والأنسجة
مُعدِّلات الأجسام المضادة
الأجسام المضادة العلاجية البيولوجية

يمكن استخدام مجموعات AlphaLISA SureFire Ultra للأغراض التالية:

فحوصات الكيناز الخلوي
دراسات تنشيط المستقبلات
الفحص عالي الإنتاجية للدراسات ما قبل السريرية
كيف يعمل؟
مبدأ اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra
يقيس اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra مستوى التعبير عن بروتين مستهدف في مستخلص خلوي.
يستخدم اختبار Total-AlphaLISA SureFire Ultra نوعين من الأجسام المضادة التي تتعرف على موقعين مختلفين على البروتين المستهدف. تتطلب اختبارات AlphaLISA نوعين من الخرز: خرز المستقبل وخرز المانح. يُغطى خرز المستقبل بعامل CaptSure™ الخاص لتثبيت الجسم المضاد الخاص بالاختبار، والموسوم بعلامة CaptSure. أما خرز المانح فيُغطى بالستربتافيدين لالتقاط أحد الأجسام المضادة للكشف، وهو مُرتبط بالبيوتين. في وجود البروتين المستهدف، يُقرّب الجسمان المضادان خرز المانح والمستقبل من بعضهما، حيث ينقل الأكسجين الأحادي الطاقة لإثارة خرز المستقبل، مما يسمح بتوليد إشارة ألفا مضيئة. تتناسب كمية الضوء المنبعث طرديًا مع كمية البروتين الموجودة في العينة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra ثنائي الألواح
يتضمن بروتوكول الصفيحتين زراعة الخلايا ومعالجتها في صفيحة ذات 96 بئراً قبل تحللها، ثم نقل المستخلصات إلى صفيحة OptiPlate™ ذات 384 بئراً قبل إضافة كواشف الكشف Total-AlphaLISA SureFire Ultra. يسمح هذا البروتوكول بمراقبة حيوية الخلايا وكثافتها. إضافةً إلى ذلك، يمكن استخدام المستخلصات من بئر واحد لقياس أهداف متعددة.

بروتوكول فحص Total-AlphaLISA SureFire Ultra أحادي اللوحة
يمكن الكشف عن البروتين المستهدف الكلي باستخدام كواشف AlphaLISA SureFire Ultra في صفيحة واحدة تُستخدم للزراعة والمعالجة والتحليل. لا حاجة لخطوات غسل. يتيح هذا البروتوكول المصمم بتقنية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) تصغير حجم العينة مع الحفاظ على جودة AlphaLISA SureFire Ultra.
تنوع التحليل
التعبير عن STAT3 في مختلف أنواع الخلايا
تمت زراعة الخلايا الملتصقة حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون، ثم تم تحليلها باستخدام محلول التحلل عند كثافة 100,000 خلية/مل. تم غسل الخلايا المعلقة وتحليلها باستخدام محلول التحلل 5X عند كثافة 300,000 خلية/مل.
تم تقييم مستويات STAT3 باستخدام اختبار AlphaLISA SureFire فائق الأداء. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلية (حوالي 1000 خلية ملتصقة و3000 خلية معلقة) إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة على جهاز Envision باستخدام إعدادات AlphaLISA القياسية.
حساسية الفحص
حساسية اختبار ST3 عالي الأداء

زُرعت خلايا THP-1 في صفيحة ذات 96 بئراً (50000 خلية/بئر) في وسط كامل يحتوي على 100 نانومول من PMA، وحُضنت لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون. جُوّعت الخلايا البلعمية المشتقة من THP-1 في محلول HBSS + 0.1% BSA لمدة ساعتين، ثم حُفزت بتراكيز متزايدة من IFNα لمدة 20 دقيقة.
بعد المعالجة، تم تحليل الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من محلول التحليل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج (350 دورة في الدقيقة). تم تقييم مستويات STAT3 الفوسفورية (Tyr705) والمستويات الكلية باستخدام اختبارات AlphaLISA SureFire Ultra STAT3 المناسبة. في خطوة الكشف، تم نقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلية (حوالي 5000 خلية) إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئراً، ثم أضيف إليها 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تم قراءة الصفيحة باستخدام جهاز Envision وفقًا لإعدادات AlphaLISA القياسية.

تم تحضير مستخلص الخلايا من خلايا A431 التي تمت زراعتها حتى وصلت إلى مرحلة التكاثر الكامل في قارورة T175 المعالجة بـ 2 ميكروغرام/مل من عامل نمو البشرة لمدة 10 دقائق وتم تحليلها في 10 مل من محلول التحلل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج.
تم تخفيف مستخلص الخلايا بشكل متسلسل في محلول التحلل، وقُيِّمت مستويات STAT3 الفوسفوري (Tyr705) والمستويات الكلية باستخدام فحوصات AlphaLISA SureFire فائقة الأداء لـ STAT3. في خطوة الكشف، نُقل 10 ميكرولتر من مستخلص الخلايا إلى صفيحة OptiPlate بيضاء ذات 384 بئرًا، ثم أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المستقبل، وحُضِّنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُضيف 5 ميكرولتر من مزيج المانح إلى كل بئر، وحُضِّنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قُرئت الصفيحة على جهاز Envision باستخدام إعدادات AlphaLISA القياسية.
يُشار إلى العدد التقريبي للخلايا. يُمثل الخط المنقط خلفية التحليل. يتميز تحليل STAT3 عالي الأداء بنطاق ديناميكي واسع، ويمكنه الكشف عن تعبير STAT3 في أقل من 50 خلية/نقطة بيانات.
تطبيق - إشارات الخلية
متوافق مع أنظمة التشغيل الآلي - نعم
العلامة التجارية: ألفا ليسا شورفاير ألترا
طريقة الكشف - ألفا
مدة البروتوكول: ساعتان في درجة حرارة الغرفة
حجم العينة - 10 ميكرولتر
شروط الشحن - يتم الشحن في ثلج أزرق
الهدف-STAT3
البروتينات الفوسفورية من الفئة المستهدفة
الأنواع المستهدفة: الإنسان والفأر
تكنولوجيا ألفا
المجال العلاجي: الالتهاب، علم الأعصاب، الأورام
حجم الوحدة: 50,000 نقطة تحليل