Thermo Fisher، 4387299، مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™

مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ من Ambion™ تُمكّن من إجراء تحليل التعبير الجيني مباشرةً من أعداد محدودة أو صغيرة من الخلايا المزروعة دون الحاجة إلى تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA). يتضمن البروتوكول خطوة تضخيم وسيطة (التضخيم المسبق) بين النسخ العكسي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (PCR) في الوقت الحقيقي، حيث يتم إثراء الحمض النووي التكميلي (cDNA) لما يصل إلى 100 هدف جيني يختاره المستخدم دون أي تحيز في التضخيم.
• حل كامل ومُدقَّق - يتضمن سير العمل المُحسَّن كواشف تحلل الخلايا، وإنزيم DNase، وكواشف النسخ العكسي، وكواشف PreAmp، ومزيج TaqMan™ الرئيسي للتعبير الجيني
• سريع وبسيط ومريح - جهّز العينات في 7 دقائق؛ تخلص من عملية عزل الحمض النووي الريبي (RNA) المرهقة
• توسيع نطاق العينات المحدودة - زيادة إمكانات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي بما يصل إلى 64 ضعفًا؛ دراسة ما يصل إلى 100 جين في وقت واحد
• نتائج دقيقة - تضخيم موحد دون إدخال أي تحيز
• أداء قوي - كشف خطي من 10 إلى 100000 خلية؛ نتائج مكافئة للحمض النووي الريبي النقي. حل كامل ومعتمد. يتميز طقم TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ بطريقة فريدة لتحليل الخلايا المزروعة مع إزالة الحمض النووي الجينومي والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، ويحتوي على كواشف النسخ العكسي (RT) لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)، ومزيج TaqMan™ PreAmp Master Mix للتضخيم المسبق لما يصل إلى 100 هدف جيني، ومزيج TaqMan™ Gene Expression Master Mix لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (PCR).
تحضير عينة بسيط ومريح في 7 دقائق: تتضمن مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ إجراءً بسيطًا لتحضير العينة في 7 دقائق فقط (الشكل 1) لاستخدامها مع 10-100,000 خلية مستنبتة لكل عينة. تُغسل الخلايا بمحلول الفوسفات الملحي (PBS) وتُحلل في المحلول لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة؛ ويمكن إجراء معالجة DNase في الوقت نفسه. يُوقف التحلل في درجة حرارة الغرفة عن طريق حضانة لمدة دقيقتين مع محلول الإيقاف.
أصبحت المستخلصات جاهزة الآن لعملية النسخ العكسي أو التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. ولأن العينات يمكن معالجتها مباشرةً في أطباق الاستنبات (96 أو 384 بئرًا)، يتم تقليل التعامل مع العينات واحتمالية فقدانها أو حدوث أخطاء في نقلها إلى أدنى حد، مما يسهل استخدام العينات المحدودة. لا حاجة للتسخين أو الغسل أو الطرد المركزي؛ إذ تُبسط هذه المجموعة بشكل كبير عمليةً كانت تستغرق وقتًا طويلاً وجهدًا كبيرًا، وتختصرها إلى 7 دقائق فقط.
توسيع نطاق العينات المحدودة - زيادة إمكانات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي بما يصل إلى 64 ضعفًا. يعمل دمج تقنية Cells-to-CT™ مع إمكانية التضخيم المسبق على تبسيط سير العمل متعدد الخطوات مع توسيع نطاق عدد تفاعلات البوليميراز المتسلسل الممكنة من العينات الثمينة بشكل كبير (أكثر من 60 ضعفًا)، ويزيد من حساسية الكشف عن الحمض النووي الريبوزي المرسال من كميات صغيرة من مدخلات العينة.
يبدأ تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي القياسي لتحليل التعبير الجيني بنسخ الحمض النووي الريبوزي الكلي عكسيًا إلى الحمض النووي التكميلي باستخدام بادئات عشوائية وأوليجو dT، يليه تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستخدام بادئات ومجسات خاصة بالجينات (الشكل 2). مع مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™، تُجرى خطوة تضخيم وسيطة (التضخيم المسبق) بين النسخ العكسي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، حيث يُثرى الحمض النووي التكميلي بما يصل إلى 100 هدف جيني يختاره المستخدم دون تحيز في التضخيم. يُخفف ناتج التضخيم المسبق ويُستخدم كمادة أولية لتحليلات TaqMan™ الفردية اللاحقة للتعبير الجيني باستخدام مزيج TaqMan™ الرئيسي للتعبير الجيني، المضمن في المجموعة. تُوسع عملية TaqMan™ PreAmp العينات بشكل فعال حتى 64 ضعفًا، مما يُتيح إجراء تحليلات لم تكن ممكنة سابقًا باستخدام عينات محدودة.
نتائج دقيقة - تضخيم متساوٍ دون تحيز: تُعدّ القدرة على إجراء تضخيم أولي موثوق وموحد أمرًا بالغ الأهمية لتحليل التعبير الجيني من عينات محدودة. في حين تتوفر طرق أخرى لتضخيم الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو الحمض النووي المكمل (cDNA) مسبقًا، إلا أنها تستخدم بادئات غير نوعية لتضخيم المادة الأولية، مما يؤدي إلى تضخيم متحيز وغير دقيق لبعض النسخ على حساب غيرها. يستخدم مزيج TaqMan™ PreAmp Master Mix، وهو جزء من مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™، بادئات نوعية للجينات لتضخيم الحمض النووي المكمل (cDNA) مسبقًا، مما ينتج عنه تضخيم غير متحيز. تُظهر مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ تضخيمًا أوليًا غير متحيز يُعادل الحمض النووي الريبوزي (RNA) النقي عند مقارنته عبر 100 اختبار مختلف للتعبير الجيني بتقنية TaqMan. كما هو موضح في الشكل 3، لا يُدخل تفاعل التضخيم الأولي أي تحيز من مستخلصات Cells-to-CT™ أو العينات النقية. ≥ 92% من التحليلات كانت ضمن نطاق +⁄- 1.
5 ΔΔ CT للـ cDNA المضخم مسبقًا مقابل غير المضخم من الحمض النووي الريبي المنقى (A) أو من مستخلصات Cells-to-CT™ Kit (B).
أداء قوي - نتائج مكافئة للحمض النووي الريبي النقي: تم تقييم أداء مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ باستخدام 100 اختبار TaqMan™ مختلف، وذلك باستخدام مستخلصات Cells-to-CT™ أو الحمض النووي الريبي النقي، سواءً مع التضخيم المسبق أو بدونه. كما هو موضح في الشكل 4، كانت قيم العتبة (CT) التي تم الحصول عليها باستخدام مستخلصات مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ مكافئة، بل وأفضل في كثير من الأحيان، من قيم العتبة التي تم الحصول عليها باستخدام الحمض النووي الريبي النقي، سواءً قبل (أ) أو بعد (ب) التضخيم المسبق. يُعزى المستوى العالي من الأداء لمستخلصات مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ إلى الحفاظ على الحمض النووي الريبي في العينات الأولية دون فقدانه نتيجة التسخين أو النقل أو الامتزاز على المصفوفات.
الكشف الخطي من 10 إلى 100,000 خلية: يجب أن تكون كل خطوة من خطوات سير العمل لتحليل الحمض النووي الريبوزي (RNA) فعّالة للعمل مع عدد قليل أو كبير من الخلايا. تم تحسين مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ لتوليد خطية فعّالة عبر 5 لوغاريتمات من مدخلات الخلايا، من 10 إلى 100,000 خلية لكل تفاعل تحلل (الشكل 5). علاوة على ذلك، ولتحقيق أقصى حساسية، تسمح مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ بأن يتكون ما يصل إلى 45% من حجم تفاعل النسخ العكسي (RT) من مستخلص العينة. توفر مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ حساسية قصوى مستمدة من حجم المستخلص الكبير المستخدم في تفاعل النسخ العكسي، وظروف تفاعل النسخ العكسي المُحسّنة، والتضخيم المسبق للعينة قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (PCR).
أداءٌ مُثبت، مُثبتٌ معًا: تم تحسين جميع مكونات مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ لضمان أداءٍ ثابتٍ وموثوق. هذا يُغني عن التخمين المُصاحب لتجميع مجموعات تحضير العينات، والنسخ العكسي، والتضخيم المُسبق، وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي بشكلٍ مُنفصل. ولضمان جودةٍ إضافية، تم التحقق من صحة مجموعة TaqMan™ PreAmp Cells-to-CT™ باستخدام فحوصات TaqMan™ للتعبير الجيني.
للاستخدام مع (الأجهزة): نظام 7000، نظام 7300، نظام 7500، نظام 7900HT، نظام Applied Biosystems StepOnePlus™ Fast Real-Time PCR، StepOne™، الوضع القياسي، StepOnePlus™، الوضع القياسي، أنظمة QuantStudio 6 و7 Pro، نظام QuantStudio 7 Flex، أنظمة QuantStudio 3 و5، نظام QuantStudio 12k Flex، نظام QuantStudio 6 Flex
التنسيق: مجموعة
الميزات الصديقة للبيئة: استخدام موارد أقل ونفايات أقل، مخاطر أقل
عدد التفاعلات: 40 تفاعلاً
صبغة مرجعية سلبية: ROX (مخلوطة مسبقًا)
بوليميراز: بوليميراز الحمض النووي
خط الإنتاج: Ambion™، Cells-to-CT™، TaqMan™
نوع المنتج: طقم تحويل الخلايا إلى C لمضخم الصوت
درجة النقاء أو الجودة: UP (نقي للغاية)
الكمية: 40 تفاعلاً
إنزيم النسخ العكسي: M-MLV
نوع العينة: خلية
شروط الشحن: ثلج جاف
يكفي لـ: 40 تفاعلًا
طريقة الكشف: البادئ والمسبار
للاستخدام مع (التطبيق): التضخيم المسبق
أداء تفاعل البوليميراز المتسلسل الغني بالـ GC: منخفض
طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل: تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي على مرحلتين
سرعة رد الفعل: قياسية
حجم الوحدة: كل وحدة