Thermo Fisher، L150201، مجموعة GeneRacer™ مع SuperScript™ III RT ومجموعة TOPO TA Cloning™ للتسلسل

مجموعة GeneRacer™ مع SuperScript™ III RT ومجموعة TOPO TA Cloning™ للتسلسل. توفر مجموعة GeneRacer™ طريقةً للحصول على نهايات cDNA كاملة الطول 5' و3' باستخدام تسلسل cDNA معروف من علامات التسلسل المعبر عنها (ESTs)، أو cDNA المطروح، أو العرض التفاضلي، أو فحص المكتبة. تضمن المجموعة تضخيم النسخ كاملة الطول فقط عن طريق استبعاد الرسائل المبتورة من عملية التضخيم. يمكن استنساخ منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل RACE بسرعة وسهولة باستخدام إما مجموعة Zero Blunt™ TOPO™ PCR Cloning Kit للتسلسل (منتجات PCR ذات النهايات غير المتداخلة) أو مجموعة TOPO TA Cloning™ للتسلسل (منتجات PCR ذات نهايات 3' A بارزة). باستخدام البروتوكولات المتوفرة، يمكن تضخيم وتسلسل نهايات cDNA للنسخ النادرة (30 نسخة/خلية) والطويلة (9 كيلوبايت) بدءًا من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الكلي. مع مجموعة GeneRacer™، يمكنك:
• توليد الحمض النووي التكميلي (cDNA) من نسخ لا يقل طولها عن 10 كيلوبايت
• الحصول على الطرف 5' كامل الطول للنسخ النادرة التي يقل عدد نسخها عن 30 نسخة لكل خلية
• استنساخ نهايتي 5' و3' كاملتين لبناء تسلسل cDNA كامل. يتوفر طقم GeneRacer™ مع إنزيم النسخ العكسي SuperScript™ III RT لتحسين تضخيم النهاية 5' كاملة الطول من mRNA الطويل والمعقد. تم تعديل جزء RNase H من SuperScript™ III RT لتجنب قطع mRNA أثناء تخليق cDNA، مما يزيد من حجم وكمية cDNA الناتج. يتميز SuperScript™ III RT بثبات حراري أعلى من إنزيمات النسخ العكسي التقليدية، مما يُمكّن من النسخ العكسي في درجات حرارة أعلى، ويُخفف من البنية الثانوية للقوالب المعقدة، ويسمح باكتمال تخليق cDNA. آلية عمل طقم GeneRacer™: يضمن طقم GeneRacer™ تضخيم النسخ التي تحتوي فقط على نهايات cDNA كاملة الطول (انظر الشكل). يبدأ البروتوكول المتقدم على مستوى RNA باستهداف mRNA ذي غطاء 5' فقط. في الخطوات اللاحقة، يُزال الغطاء ويُستبدل بـ GeneRacer™ RNA Oligo. أثناء عملية النسخ العكسي، يتم دمج تسلسل أوليغونوكليوتيد الحمض النووي الريبوزي GeneRacer™ في الحمض النووي المكمل (cDNA). يحتوي الحمض النووي المكمل (cDNA) الذي تم نسخه عكسيًا بالكامل فقط على هذا التسلسل المعروف. بعد ذلك، يُجرى تفاعل البوليميراز المتسلسل 5´ RACE باستخدام بادئ GeneRacer™ 5´ الخاص بتسلسل أوليغونوكليوتيد الحمض النووي الريبوزي GeneRacer™ وبادئ خاص بالجين. والنتيجة هي حمض نووي مُضخّم يحتوي على تسلسل الحمض النووي المكمل (cDNA) كامل الطول 5´. الحساسية والطول: لإثبات قدرة مجموعة GeneRacer™ على التقاط نهاية الحمض النووي المكمل (cDNA) كاملة الطول 5´، تم تضخيم نهايات 5´ للجينات ذات مواقع بدء النسخ المعروفة. بدءًا من الحمض النووي الريبوزي الكلي (RNA) واتباعًا لبروتوكول GeneRacer™، تم تضخيم كل من النسخ الطويلة (10 كيلوبايت) والرسائل النادرة الموجودة بنسبة 0.01%، أو 30 نسخة لكل خلية (انظر الشكل). سلالة بكتيرية أو خميرة: TOP10
طريقة الاستنساخ: TOPO TA
للاستخدام مع (التطبيق): النسخ العكسي
يشمل: وحدة GeneRacer: 2 × 1.5 مل من الماء المعقم، 24 ميكرولتر من RNaseOut، 6 ميكرولتر من كل من فوسفاتاز الأمعاء العجلية (CIP)، ومحلول CIP، وبيروفوسفاتاز حمض التبغ (TAP)، ومحلول TAP بتركيز 10X، وإنزيم ربط الحمض النووي الريبي T4، ومحلول ربط الحمض النووي الريبي T4 بتركيز 10X، و10 ملي مولار من ATP، و6 × 250 نانوغرام من قليل النوكليوتيدات RNA لـ GeneRacer، و2 × 1 مل من الفينول/الكلوروفورم، و36 ميكرولتر من جليكوجين بلح البحر، و200 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم (3 مولار)، و225 ميكرولتر من كل من بادئ GeneRacer 5'، وبادئ 5' المتداخل، وبادئ 3'، وبادئ 3' المتداخل، و20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الكلي لخلايا HeLa (500 نانوغرام/ميكرولتر)، و15 ميكرولتر من كل عنصر تحكم البادئ A والبادئ الضابط B.1؛ وحدة النسخ العكسي SuperScript III: 6 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي SuperScript III (200 وحدة/ميكرولتر)، 24 ميكرولتر من محلول التخزين المؤقت للسلسلة الأولى 5X، 15 ميكرولتر من DTT (0.1 مولار)، 6 ميكرولتر من RNaseH (2 وحدة/ميكرولتر)، 6 ميكرولتر من البادئات العشوائية (100 نانوغرام/ميكرولتر)، 6 ميكرولتر من بادئ GeneRacer Oligo dT (900 نانوغرام/ميكرولتر)، 6 ميكرولتر من مزيج dNTP (10 ملي مولار لكل منها)، 10 أعمدة SNAP، مجموعة استنساخ TOPO TA للتسلسل (-20 درجة مئوية)، كمية كافية من الكواشف، وبكتيريا الإشريكية القولونية One Shot TOP10 المؤهلة كيميائيًا
خط الإنتاج: GeneRacer™، SuperScript™، TA Cloning™، TOPO™
نوع المنتج: طقم استنساخ
الكمية: طقم واحد
المتجه: pCR4-TOPO TA
التنسيق: مجموعة
حجم الوحدة: كل وحدة