BD, 557793, Conjunto de enriquecimiento de linfocitos T de ratón BD IMag™-DM

Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869096
Descripción: El kit de enriquecimiento de linfocitos T de ratón BD IMag™ - DM se utiliza para la selección negativa de linfocitos T del bazo o ganglio linfático de ratón. El cóctel de enriquecimiento de linfocitos T de ratón biotinilado contiene anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos expresados ​​en eritrocitos y leucocitos periféricos que no son linfocitos T. Las partículas de estreptavidina Plus BD IMag™ - DM son nanopartículas magnéticas que tienen estreptavidina conjugada covalentemente a sus superficies. Con estos dos componentes, el kit de enriquecimiento de linfocitos T de ratón BD IMag™ - DM evita la activación accidental de los linfocitos T enriquecidos mediante reactivos que no se unen directamente a dichas células T. Este kit se ha optimizado para su uso con el imán de separación celular BD IMag™ y contiene suficientes reactivos para marcar 10^9 leucocitos. El cóctel de enriquecimiento de linfocitos T de ratón biotinilados se compone de los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con biotina: Anti-CD11b de ratón, clon M1/70 Anti-CD45R/B220 de ratón, clon RA3-6B2 Anti-CD49b de ratón, clon HMα2 Anti-TER-119 de ratón/células eritroides, clon TER-119
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con biotina en condiciones óptimas y se eliminó la biotina no reaccionada. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: A continuación, se detalla el protocolo de enriquecimiento y marcado magnético. En resumen, el cóctel de enriquecimiento de linfocitos T de ratón biotinilados tiñe simultáneamente los eritrocitos y la mayoría de los leucocitos, excepto los linfocitos T. Tras eliminar el exceso de anticuerpos, se añaden BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM a la suspensión celular, que se une a las células que contienen los anticuerpos biotinilados. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca en el campo magnético del imán de separación celular BD IMag™ (n.º de cat. 552311). Se realiza una selección negativa para enriquecer las células T no marcadas. Las células marcadas migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan extraerse y retenerse (fracción enriquecida). La selección negativa se repite dos veces para aumentar el rendimiento de la fracción enriquecida. Si se requiere una mayor pureza, se puede realizar una selección negativa en la fracción enriquecida. Los pasos de separación magnética se detallan en el diagrama de flujo de enriquecimiento. Las fracciones positivas y enriquecidas pueden evaluarse en aplicaciones posteriores, como citometría de flujo y cultivo tisular. Los anticuerpos del cóctel de enriquecimiento de linfocitos T de ratón biotinilados se han optimizado y prediluido para maximizar la eficiencia del enriquecimiento de linfocitos T de órganos linfoides periféricos. PROTOCOLO DE ETIQUETADO MAGNÉTICO Y ENRIQUECIMIENTO 1. Todos los pasos de etiquetado y enriquecimiento pueden realizarse en medio de cultivo tisular* o en tampón BD IMag™ 1X estéril. - Para tampón BD IMag™ 1X: Diluya el tampón BD IMag™ (10X) (n.° de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con fosfato suplementada con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1 %. 2. Prepare asépticamente una suspensión de células individuales del tejido linfoide periférico de interés. Retire los grumos de células o residuos pasando las células suspendidas por un filtro de nailon de 70 µm. Las suspensiones celulares pueden prepararse en medio de cultivo tisular* o tampón BD IMag™ 1X. 3. Contar las células. Si la concentración está entre 10 x 10^6 y 20 x 10^6 células/ml, continúe con el paso 4. Si las células están más diluidas, centrifugarlas y resuspenderlas en medio de cultivo tisular* o tampón BD IMag™ 1X a una concentración de 20 x 10^6 células/ml. 4. Añada el cóctel de enriquecimiento de linfocitos T de ratón bioinilados a 5 µl por cada 10 células e incube en hielo durante 15 minutos.† 5. Lave las células marcadas con un exceso de volumen de 10 veces el de medio de cultivo tisular* o tampón BD IMag™ 1X, centrifugue a 300 xg durante 7 minutos y aspire cuidadosamente TODO el sobrenadante. 6. Mezcle bien las partículas de estreptavidina BD IMag™ Plus - DM y añada 5 µl de partículas por cada 10 células totales. 7. MEZCLE COMPLETAMENTE. Refrigere durante 30 minutos a 6 °C - 12 °C.† 8. Lleve la concentración de marcado a 20-80 x 10 células/ml con medio de cultivo tisular* o tampón BD IMag™ 1X. 9. Transfiera las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm; el volumen máximo añadido no debe exceder 1,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva sobre el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos.† - Para un mayor volumen, transfiera las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm; el volumen máximo añadido no debe exceder 3,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva sobre el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos.† 10. Con el tubo sobre el imán de separación celular y utilizando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, aspire cuidadosamente el sobrenadante (fracción enriquecida) y colóquelo en un nuevo tubo estéril. 11. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue medio de cultivo tisular* o tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 8. Resuspenda el pocillo de fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos.† - Para tubos de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos.† 12. Con una pipeta Pasteur estéril nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción enriquecida del paso 10 anterior. 13. Repita los pasos 11 y 12. La fracción enriquecida combinada contiene linfocitos T sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. Estas células están listas para aplicaciones posteriores, o pueden enriquecerse aún más procediendo al Paso 15. 14. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original pueden resuspenderse en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo, si se desea. 15. Para aumentar la pureza de la fracción enriquecida combinada en otro 3% a 5% (compare los paneles del medio izquierdo y medio derecho en la figura), coloque el tubo que contiene la fracción enriquecida combinada en el imán de separación celular durante otros 6 a 8 minutos.† - Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos.† 16. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo estéril. Esta es la fracción dos veces enriquecida. Las células están listas para procesarse para aplicaciones posteriores. 17. Las muestras de la suspensión celular total y las fracciones positiva y enriquecida deben analizarse mediante citometría de flujo para evaluar la eficiencia del procedimiento de separación celular. NOTAS: * Algunos medios de cultivo tisular contienen biotina, que puede interferir con la unión de las partículas de estreptavidina. Recomendamos el Medio Mínimo Esencial de Dulbecco (DMEM). † Evite el etiquetado inespecífico trabajando con rapidez y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos.
Descripción: ID de EntrezGene
N/D : N/D