BD, 557812, BD IMag™ Partículas de estreptavidina Plus - DM

Aplicación: Separación celular (probado durante el desarrollo)
ID de registro: AB_10050580
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de Ensayo Recomendados: A continuación, se presenta un protocolo detallado de Marcaje y Separación Magnética. En resumen, las células se marcan con el anticuerpo biotinilado, que reconoce la subpoblación de interés. Tras eliminar el exceso de anticuerpo, se añaden BD IMag™ Streptavidin Particles Plus -DM a la suspensión celular, que une el anticuerpo biotinilado a las células. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca dentro del campo magnético del Imán de Separación Celular (n.° de cat. 552311). A continuación, se realiza la selección positiva o depleción. Las células marcadas migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan ser extraídas (fracción deplecionada o negativa). A continuación, se retira el tubo del campo magnético para resuspender la fracción positiva. Las selecciones se repiten dos veces para aumentar la pureza de la fracción positiva y el rendimiento de la fracción deplecionada. Los pasos de la separación magnética se detallan en los diagramas de flujo de depleción y selección positiva adjuntos. El pequeño tamaño de las partículas BD IMag™ permite evaluar la fracción positiva en aplicaciones posteriores, como la citometría de flujo. Concentraciones óptimas de partículas de estreptavidina BD IMag™ Plus -DM para la selección positiva con algunos anticuerpos monoclonales biotinilados contra antígenos leucocitarios humanos y murinos. Número de catálogo Anticuerpo Clon Especificidad del anticuerpo BD IMag Estreptavidina Concentración de partículas Tejido utilizado 555411 HIB19 Humano CD19 20 µl/10^7 células totales PBMC 555338 HIT3a Humano CD3 20 µl/10^7 células totales PBMC 551331 RA3-6B2 Ratón CD45R 20 µl/10^7 células totales Bazo 551335 30-H12 Ratón CD90.2 20 µl/10^7 células totales Bazo 551326 53-6.7 Ratón CD8a 20 µl/10^7 células totales Bazo 551324 RM4-5 Ratón CD4 10 µl/10^7 células totales Bazo 551328 M1/70 Ratón CD11b 20 µl/10^7 células totales Médula ósea 551333 RB6-8C5 Ratón Ly-6G/Ly-6C 50 µl/10^7 células totales Médula ósea Para el agotamiento de células hematopoyéticas de ratón que portan marcadores específicos de linaje, recomendamos el juego de enriquecimiento de células madre hematopoyéticas de ratón BD™ IMag - DM (n.º de cat. 558451). PROTOCOLO DE SEPARACIÓN Y ETIQUETADO MAGNÉTICO 1. Prepare los tampones y colóquelos en hielo. a. Tampón de tinción celular: solución salina tamponada con fosfato, suero fetal bovino inactivado por calor al 3 %, azida sódica al 0,1 %. b. Tampón BD IMag 1X: Diluya el tampón BD™ IMag (10X) (n.° de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con fosfato, suplementada con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1 %*. 2. Prepare asépticamente una suspensión de células individuales del tejido linfoide de interés o PBMC a partir de sangre anticoagulada, preferiblemente mediante centrifugación en gradiente de densidad con la solución Ficoll-Hypaque de densidad adecuada. Elimine los grumos de células o los residuos pasando las células suspendidas por un filtro de nailon de 70 µm. 3. Cuente las células y resuspéndalas en tampón de tinción celular a una concentración de 2 x 10^7 células/ml. 4. Opcional: Si es necesario, añada BD Mouse Fc Block™ Purified Anti-Mouse CD16/CD32 mAb 2.4G2 (n.º de cat. 553141/553142) o BD Rat Fc Block™ Purified Anti-Rat CD32 mAb D34-485 (n.º de cat. 550270/550271) a 0,25 µg/10^6 células e incube en hielo durante 15 minutos. 5. Añada el anticuerpo biotinilado (o cóctel de anticuerpos biotinilados) a la concentración adecuada e incube en hielo durante 15 minutos.† 6. Lave las células marcadas con un exceso de volumen de tampón BD IMag™ 1X y aspire con cuidado TODO el sobrenadante. Para las depleciones, proceda al Paso 7. Para las selecciones positivas, proceda al Paso 18. Depleciones: 7. Agite bien las BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM y añada 50 µl de partículas por cada 1 x 10^7 células totales. 8. MEZCLE COMPLETAMENTE. Refrigere los leucocitos de ratón o rata durante 30 minutos a 6 °C - 12 °C. Incube las PBMC humanas a temperatura ambiente durante 30 minutos.† 9. Lleve el volumen de marcaje de 2 a 8 x 10^7 células/ml con tampón BD IMag™ 1X o medio de cultivo.* 10. Transfiera las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm; el volumen máximo añadido no debe superar 1,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos. Para un mayor volumen, transfiera las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm, sin exceder los 3 ml de volumen añadido. Coloque este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 11. Con el tubo en el imán de separación celular y utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, aspire cuidadosamente el sobrenadante (fracción agotada) y colóquelo en un tubo nuevo. 12. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y añada tampón BD IMag™ 1X (o medio) hasta alcanzar el mismo volumen que en el paso 9. Resuspenda el pocillo de fracción positiva pipeteando de arriba a abajo de 10 a 15 veces y vuelva a colocarlo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. -Tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 13. Usando una pipeta Pasteur nueva, aspire cuidadosamente el sobrenadante (fracción de lavado) y combínelo con la fracción agotada del Paso 11 anterior. 14. Repita los Pasos 12 y 13. La fracción agotada combinada contiene células sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. Estas células están listas para aplicaciones posteriores, o pueden enriquecerse aún más procediendo al Paso 16. 15. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original pueden resuspenderse en un tampón o medio de cultivo apropiado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo. 16. Para aumentar la pureza de la fracción agotada combinada, coloque el tubo en el imán de separación celular durante otros 6 a 8 minutos. -Tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 17. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y colóquelo en un tubo nuevo. Esta es la fracción agotada final. Las células están listas para procesarse para aplicaciones posteriores. Selecciones positivas: 18. Agite bien el BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM y añada de 10 a 50 µl de partículas por cada 1 x 10^7 células totales. La cantidad de partículas a añadir variará en función de la cantidad de células objetivo y de la densidad de la superficie celular del antígeno. Consulte la información sobre la concentración óptima en la página 2 para ver algunos ejemplos comunes. 19. MEZCLE COMPLETAMENTE. Refrigere los leucocitos de ratón o rata durante 30 minutos a 6 °C - 12 °C. Incube las PBMC humanas a temperatura ambiente durante 30 minutos.† 20. Aumente el volumen de marcaje de 2 a 8 x 10^7 células/ml con tampón BD IMag™ 1X. 21. Coloque inmediatamente el tubo sobre el imán de separación celular e incube de 6 a 8 minutos. 22. Con el tubo en el imán de separación celular, aspire con cuidado el sobrenadante. Este sobrenadante se considera la fracción negativa. 23. Retire el tubo del imán de separación celular y añada tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 20. Resuspenda suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 2 a 4 minutos más. 24. Con el tubo en el imán de separación celular, retire con cuidado el sobrenadante (fracción de lavado). 25. Repita los pasos 23 y 24. 26. Tras el último lavado, retire el tubo del imán de separación celular. Resuspenda la fracción positiva en un tampón o medio de cultivo adecuado y proceda con las aplicaciones posteriores deseadas, incluida la citometría de flujo. NOTAS: *Para la depleción de leucocitos de ratón, el medio de cultivo tisular suele producir un ligero aumento de la viabilidad y la recuperación, en comparación con el tampón IMag, sin reducir la pureza celular. Recomendamos que los investigadores realicen una comparación de prueba del medio con el tampón para asegurarse de que no haya efectos adversos. †Evite el etiquetado no específico trabajando rápidamente y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Avisos del producto. Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Se debe utilizar un control de isotipo a la misma concentración que el anticuerpo de interés. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Para conocer los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las hojas de datos de seguridad (SDS). Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.