BD, 557874, Conjunto de enriquecimiento de linfocitos T humanos BD IMag™-DM

Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869103
Descripción: El kit de enriquecimiento de linfocitos T humanos BD IMag™ - DM se utiliza para la selección negativa de linfocitos T de sangre periférica. El cóctel de enriquecimiento de linfocitos T humanos con biotina contiene anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos expresados ​​en eritrocitos, plaquetas y leucocitos periféricos que no son linfocitos T. Las partículas de estreptavidina Plus BD IMag™ - DM son nanopartículas magnéticas que tienen estreptavidina conjugada covalentemente a sus superficies. Con estos dos componentes, el kit de enriquecimiento de linfocitos T humanos BD IMag™ - DM evita la activación accidental de los linfocitos T enriquecidos mediante reactivos que no se unen directamente a dichas células T. Este kit de enriquecimiento se ha optimizado para su uso con el imán de separación celular BD IMag™ y contiene suficientes reactivos para marcar 10^9 células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El componente T Lymphocyte Enrichment Cocktail está compuesto por los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con biotina: Anti-humano CD11b/Mac-1 (CR3), clon ICRF44 Anti-humano CD16, clon 3G8 Anti-humano CD19, clon HIB19 Anti-humano CD36, clon CB38 (NL07) Anti-humano CD41a, clon HIP8 Anti-humano CD56, clon B159 Anti-humano CD235a (Glicoforina A), clon GA-R2 (HIR2)
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con biotina en condiciones óptimas y se eliminó la biotina no reaccionada. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: A continuación, se detalla el protocolo de enriquecimiento y marcado magnético. En resumen, el cóctel de enriquecimiento de linfocitos T humanos biotinilados tiñe simultáneamente eritrocitos, plaquetas y la mayoría de los leucocitos, excepto los linfocitos T. Tras eliminar el exceso de anticuerpos, se añaden BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM a la suspensión celular, que se une a las células que contienen los anticuerpos biotinilados. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca en el campo magnético del imán de separación celular BD IMag™ (n.º de cat. 552311). Se realiza una selección negativa para enriquecer las células T no marcadas. Las células marcadas migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan extraerse y retenerse (fracción enriquecida). La selección negativa se repite dos veces para aumentar el rendimiento de la fracción enriquecida. Si se requiere una mayor pureza, se puede realizar una selección negativa en la fracción enriquecida. Para aclarar el procedimiento, los pasos de la separación magnética se esquematizan en el diagrama de flujo de enriquecimiento. Las fracciones enriquecidas (y positivas) pueden evaluarse en aplicaciones posteriores, como la citometría de flujo y el cultivo de tejidos. Los anticuerpos del cóctel de enriquecimiento de linfocitos T humanos biotinilados se han optimizado y prediluido para maximizar la eficiencia en el enriquecimiento de linfocitos T a partir de PBMC. PROTOCOLO DE ETIQUETADO MAGNÉTICO Y ENRIQUECIMIENTO 1. Prepare el tampón BD IMag™ 1X: Diluya el tampón BD IMag™ (10X) (n.° de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1 %. 2. Prepare PBMC a partir de sangre humana anticoagulada, preferiblemente mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque™.* 3. Elimine los grumos de células o residuos pasando la suspensión a través de un filtro de nailon de 70 µm. Cuente las células y resuspéndalas en tampón BD IMag™ 1X a una concentración de 10 x 10^6 células/ml. 4. Añada el cóctel de enriquecimiento de linfocitos T humanos biotinilados a 5 µl/1 x 10^6 células e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.† 5. Lave las células marcadas con un exceso de volumen de tampón BD IMag™ 1X 10 veces superior, centrifugue a 300 × g durante 7 minutos y aspire cuidadosamente todo el sobrenadante. 6. Agite bien el BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM y añada 5 µl de partículas por cada 1 x 10^6 células totales. 7. Mezcle bien. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.† 8. Aumente el volumen de marcaje a una concentración de 20-80 x 10^6 células/ml con tampón BD IMag™ 1X. 9. Transfiera las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm; el volumen máximo añadido no debe superar 1,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva sobre el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos. - Para un volumen mayor, transfiera las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm; el volumen máximo añadido no debe superar 3,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva sobre el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 10. Con el tubo en el imán de separación celular y usando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, aspire con cuidado el sobrenadante (fracción enriquecida) y colóquelo en un nuevo tubo estéril. 11. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 8. Resuspenda bien el pocillo de fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. - Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 12. Usando una pipeta Pasteur estéril nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción enriquecida del paso 10 anterior. 13. Repita los pasos 11 y 12. La fracción enriquecida combinada contiene linfocitos T sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. Estas células están listas para aplicaciones posteriores, o pueden enriquecerse aún más procediendo al Paso 15. 14. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original pueden resuspenderse en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo, si se desea. 15. Para aumentar la pureza de la fracción enriquecida combinada en otro 2-4% (compare los paneles medio izquierdo y medio derecho en la figura), coloque el tubo que contiene la fracción enriquecida combinada en el imán de separación celular durante otros 6 a 8 minutos. - Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 16. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo estéril. Esta es la fracción dos veces enriquecida. Las células están listas para procesarse para aplicaciones posteriores. 17. Las muestras de la suspensión celular total y las fracciones positiva y enriquecida deben analizarse mediante citometría de flujo para evaluar la eficiencia del procedimiento de separación celular. NOTAS: * Consejos para una preparación exitosa de células: - Extraiga la sangre en un tubo que contenga EDTA. - Retire el plasma rico en plaquetas centrifugando una vez a 220-240 × g. - Lave 2-3 veces en PBS después de la separación por gradiente de densidad. - Después del lavado final, resuspenda las células a una concentración relativamente alta en tampón BD IMag™ 1X y proceda al paso 3. † Evite el etiquetado no específico trabajando rápidamente y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Ficoll-Paque es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Para obtener información sobre los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.
Descripción: ID de EntrezGene
N/D : N/D