BD, 557954, Conjunto de enriquecimiento de células NK de ratón BD IMag™-DM

Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869110
Descripción: El kit de enriquecimiento de células NK de ratón BD IMag™ - DM se utiliza para la selección negativa de células asesinas naturales (NK) del bazo o ganglio linfático de ratón. El cóctel de enriquecimiento de células NK de ratón biotiniladas contiene anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos expresados ​​en eritrocitos y leucocitos periféricos que no son células NK. Las partículas de estreptavidina Plus BD IMag™ - DM son nanopartículas magnéticas que tienen estreptavidina conjugada covalentemente a sus superficies. Con estos dos componentes, el kit de enriquecimiento de células NK de ratón BD IMag™ - DM evita la activación accidental de las células NK enriquecidas mediante el uso de reactivos que no se unen directamente a dichas células. Este kit ha sido optimizado para su uso con el imán de separación celular BD IMag™ y contiene suficientes reactivos para marcar 10^9 leucocitos. El cóctel de enriquecimiento de células NK de ratón biotiniladas se compone de los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con biotina: Anti-CD4 de ratón (L3T4), clon GK1.5 Anti-CD5 de ratón (Ly-1), clon 53-7.3 Anti-CD8a de ratón (Ly-2), clon 53-6.7 Anti-CD19 de ratón, clon 1D3 Anti-CD24 de ratón (antígeno termoestable), clon M1/69 Anti-Ly-6G y Ly-6C de ratón (Gr-1), clon RB6-8C5 Anti-TER-119 de ratón/células eritroides, clon TER-119
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con biotina en condiciones óptimas y se eliminó la biotina no reaccionada. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados A continuación, se detalla el protocolo de enriquecimiento y marcado magnético. En resumen, el cóctel de enriquecimiento de células NK de ratón biotiniladas tiñe simultáneamente los eritrocitos y la mayoría de los leucocitos, excepto las células NK. Después de eliminar el exceso de anticuerpos, se añaden BD IMag Streptavidin Particles Plus - DM a la suspensión celular y se unen a las células que contienen los anticuerpos biotinilados. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca dentro del campo magnético del imán de separación celular BD IMag™ (n.º de cat. 552311). A continuación, se realiza una selección negativa para enriquecer las células NK no marcadas. Las células marcadas migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan extraerse y retenerse (fracción enriquecida). La selección negativa se repite dos veces para aumentar el rendimiento de la fracción enriquecida. Para una mayor pureza, se realiza una selección negativa en la fracción enriquecida. Para aclarar el procedimiento, los pasos de la separación magnética se diagraman en el diagrama de flujo de enriquecimiento. Las fracciones enriquecidas y positivas pueden evaluarse en aplicaciones posteriores, como la citometría de flujo y el cultivo de tejidos. Los anticuerpos del cóctel de enriquecimiento de células NK de ratón biotiniladas se han optimizado y prediluido para maximizar la eficiencia en el enriquecimiento de células NK de órganos linfoides periféricos. PROTOCOLO DE ETIQUETADO MAGNÉTICO Y ENRIQUECIMIENTO 1. Prepare asépticamente una suspensión de células individuales del tejido linfoide periférico de interés. Elimine los grumos de células o los residuos pasando las células suspendidas por un filtro de nailon de 70 µm. Las suspensiones celulares deben prepararse en medio de cultivo tisular.* 2. Conteo de células. Si la concentración está entre 10 x 10^6 y 20 x 10^6 células/ml, proceda al Paso 3. Si las células están más diluidas que 10 x 10^6 células/ml, centrifugue las células y resuspéndalas en medio de cultivo de tejidos a una concentración de 20 x 10^6 células/ml. 3. OPCIONAL: Agregue el mAb anti-CD16/CD32 de ratón purificado BD Mouse Fc Block™ 2.4G2 (n.º de cat. 553141/553142) a 0,25 µg por 1 x 10^6 células e incube en hielo durante 15 minutos.† 4. Agregue el cóctel de enriquecimiento de células NK de ratón bioiniladas a 5 µl por 1 x 10^6 células e incube en hielo durante 15 minutos.‡ 5. Lave las células marcadas con un exceso de volumen de 10X de medio de cultivo tisular,* centrifugue a 300 xg durante 7 minutos y aspire cuidadosamente TODO el sobrenadante. 6. Agite bien las partículas BD™ IMag Streptavidin Particles Plus - DM y agregue 5 µl de partículas por cada 1 x 10^6 células totales. 7. MEZCLAR COMPLETAMENTE. Refrigerar durante 30 minutos a 6 °C - 12 °C.‡ 8. Llevar el volumen de marcado hasta una concentración de 20-80 x 10^6 células/ml con medio de cultivo tisular .* 9. Transferir las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm, el volumen máximo añadido no debe exceder 1,0 ml. Colocar este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos. - Para un volumen mayor, transferir las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm, el volumen máximo añadido no debe exceder 3,0 ml. Colocar este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 10. Con el tubo en el imán de separación celular y utilizando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, aspirar cuidadosamente el sobrenadante (fracción enriquecida) y colocarlo en un nuevo tubo estéril. 11. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue medio de cultivo tisular* al mismo volumen que en el paso 8. Resuspenda bien el pocillo de la fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. - Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 12. Con una pipeta Pasteur estéril nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción enriquecida del paso 10 anterior. 13. OPCIONAL: Para aumentar la recuperación en la fracción enriquecida combinada en un 5-10 % adicional sin reducir la pureza de las células NK, repita los pasos 11 y 12 una vez. 14. Coloque el tubo que contiene la fracción enriquecida combinada en el imán de separación celular durante otros 6 a 8 minutos. - Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 15. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y colóquelo en un tubo estéril nuevo. Esta fracción doblemente enriquecida contiene células NK sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas.† Las células están listas para ser procesadas para aplicaciones posteriores. 16. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original pueden resuspenderse en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluyendo citometría de flujo, si se desea. 17. Las muestras de la suspensión celular no separada y las fracciones positiva y enriquecida deben analizarse mediante citometría de flujo para evaluar la eficiencia del procedimiento de separación celular. NOTAS: * Algunos medios de cultivo tisular contienen biotina, que puede interferir con la unión de las partículas de estreptavidina. Recomendamos el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM). † El uso del mAb 2.4G2 anti-CD16/CD32 de ratón purificado BD Mouse Fc Block™ en el paso 3 aumenta el rendimiento en casi un 20% sin afectar la pureza de las células NK. Sin embargo, tenga en cuenta que esto da como resultado células NK enriquecidas que tienen mAb anti-CD16/CD32 de ratón purificado unido a su superficie, lo que puede afectar la función de esas células NK. ‡ Evite el etiquetado no específico trabajando rápidamente y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA, ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
Descripción: ID de EntrezGene
N/D : N/D