BD, 557955, Conjunto de enriquecimiento de células dendríticas de ratón BD IMag™ - DM

Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869111
Descripción: El kit de enriquecimiento de células dendríticas de ratón BD IMag™ - DM se utiliza para la selección negativa de células dendríticas (CD) del bazo o ganglio linfático de ratón. El cóctel de enriquecimiento de células dendríticas de ratón biotiniladas contiene anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos expresados ​​en eritrocitos y leucocitos periféricos que no son CD. Las partículas de estreptavidina Plus BD IMag - DM son nanopartículas magnéticas que tienen estreptavidina conjugada covalentemente a sus superficies. Con estos dos componentes, el kit de enriquecimiento de células dendríticas de ratón BD IMag - DM evita la activación accidental de las CD enriquecidas mediante el uso de reactivos que no se unen directamente a dichas CD. Este kit ha sido optimizado para su uso con el imán de separación celular BD IMag™ y contiene suficientes reactivos para marcar 10^9 leucocitos. El componente Dendritic Cell Enrichment Cocktail está compuesto por los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con biotina: Anti-CD2 de ratón (LFA-2), clon RM2-5 Anti-CD3e de ratón (cadena ε de CD3), clon 145-2C11 Anti-CD45R/B220 de ratón, clon RA3-6B2 Anti-CD49b de ratón (cadena α2 de integrina), clon HMα2 Anti-CD147 de ratón (Basigin), clon RL73 Anti-Ly-6g y Ly-6C de ratón (Gr-1), clon RB6-8C5 Anti-TER-119 de ratón/células eritroides, clon TER-119
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con biotina en condiciones óptimas y se eliminó la biotina no reaccionada. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: A continuación, se detalla el protocolo de enriquecimiento y marcado magnético. En resumen, el cóctel de enriquecimiento de células dendríticas de ratón biotiniladas tiñe simultáneamente los eritrocitos y la mayoría de los leucocitos, excepto las DC. Tras eliminar el exceso de anticuerpos, se añaden BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM a la suspensión celular, que se une a las células que contienen los anticuerpos biotinilados. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca en el campo magnético del imán de separación celular (n.º de cat. 552311). Se realiza una selección negativa para enriquecer las DC no marcadas. Las células marcadas migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan extraerse y retenerse (fracción enriquecida). La selección negativa se repite una vez para aumentar el rendimiento de la fracción enriquecida. Para una mayor pureza, se realiza una selección negativa en la fracción enriquecida. Para aclarar el procedimiento, los pasos de la separación magnética se esquematizan en el diagrama de flujo de enriquecimiento. Las fracciones enriquecidas y positivas pueden evaluarse en aplicaciones posteriores, como la citometría de flujo y el cultivo de tejidos. Los anticuerpos del cóctel de enriquecimiento de células dendríticas de ratón biotiniladas se han optimizado y prediluido para maximizar la eficiencia en el enriquecimiento de células dendríticas de ratón (CD) de órganos linfoides periféricos. PROTOCOLO DE ETIQUETADO MAGNÉTICO Y ENRIQUECIMIENTO 1. Prepare soluciones tampón estériles y colóquelas en hielo. - Tampón de tinción celular: Solución salina tamponada con fosfato suplementada con suero fetal bovino inactivado por calor al 3 % y azida sódica al 0,1 %. - Tampón BD IMag 1X: Diluya el tampón BD IMag (10X) (n.º de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con 0,5 % de BSA, 2 mM de EDTA y 0,1 % de azida sódica. 2. Prepare asépticamente una suspensión de células individuales del tejido linfoide periférico de interés. Elimine los grumos de células o restos celulares pasando las células suspendidas por un filtro de nailon de 70 µm. Las suspensiones celulares deben prepararse en tampón de tinción celular. 3. Conteo celular. Si la concentración está entre 10 x 10^6 y 20 x 10^6 células/ml, proceda al paso 4. Si las células están más diluidas que 10 x 10^6 células/ml, centrifugue las células y resuspéndalas en tampón de tinción celular a una concentración de 20 x 10^6 células/ml. 4. OPCIONAL: añada BD Mouse Fc Block Purified Anti-Mouse CD16/CD32 mAb 2.4G2 (n.º de cat. 553141/553142) a 0,25 µg por 1 x 10^6 células e incube en hielo durante 15 minutos. 5. Añada el cóctel de enriquecimiento de células dendríticas de ratón bioiniladas a 5 µl por cada 10 x células e incube en hielo durante 15 minutos.† 6. Lave las células marcadas con un exceso de volumen de 10 veces el tampón BD IMag 1X, centrifugue a 300 xg durante 7 minutos y aspire cuidadosamente todo el sobrenadante. 7. Agite bien las partículas de estreptavidina BD IMag Plus - DM y añada 5 µl de partículas por cada 10 x células totales. 8. MEZCLE COMPLETAMENTE. Refrigere durante 30 minutos a 6 °C - 12 °C.† 9. Lleve el volumen de marcado a una concentración de 20-80 x 10 x células/ml con tampón BD IMag 1X. 10. Transfiera las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm, con un volumen máximo añadido de no más de 1,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva sobre el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos. - Para un mayor volumen, transfiera las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm, con un volumen máximo añadido de no más de 3,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva sobre el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 11. Con el tubo sobre el imán de separación celular y utilizando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, aspire cuidadosamente el sobrenadante (fracción enriquecida) y colóquelo en un nuevo tubo estéril. 12. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue tampón BD IMag 1X al mismo volumen que en el paso 8. Resuspenda bien el pocillo de la fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. - Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 13. Con una pipeta Pasteur estéril nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción enriquecida del paso 10 anterior. 14. Coloque el tubo que contiene la fracción enriquecida combinada en el imán de separación celular durante otros 6 a 8 minutos. - Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 15. Aspire con cuidado el sobrenadante y colóquelo en un tubo estéril nuevo. Esta fracción dos veces enriquecida contiene DC sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. Las células están listas para ser procesadas para aplicaciones posteriores. 16. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original pueden resuspenderse en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo, si se desea. 17. Las muestras de la suspensión celular no separada y las fracciones positiva y enriquecida deben analizarse mediante citometría de flujo para evaluar la eficiencia del procedimiento de separación celular. NOTAS: - El uso de BD Mouse Fc Block™ Purified Anti-Mouse CD16/CD32 mAb 2.4G2 en el paso 4 aumenta el rendimiento en un 15-25% mientras que disminuye la pureza de las DC en un 7-15%. Tenga en cuenta que esto da como resultado DC enriquecidas que pueden tener mAb anti-CD16/CD32 de ratón purificado unido a su superficie, lo que puede afectar la función de esas DC. † Evite el etiquetado inespecífico trabajando rápidamente y adhiriéndose a los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA, ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
Descripción: ID de EntrezGene
N/D : N/D