BD, 557983, Partículas magnéticas BD IMag™ anti-IgG1 de ratón - DM

Nombre alternativo: Ighg1; Inmunoglobulina pesada constante gamma 1; Igh-4
Reactividad: Ratón (Prueba de control de calidad)
Isotipo: LOU de rata, también conocida como Louvain, LOU/C, LOU/M IgG1, κ
Inmunógeno: IgG1 de ratón agrupada
Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
ID de registro: AB_398640
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados PROTOCOLO DE SEPARACIÓN Y ETIQUETADO MAGNÉTICO 1. Prepare los siguientes tampones y colóquelos en hielo. a. Tampón de tinción celular: solución salina tamponada con fosfato, suero fetal bovino inactivado por calor al 3%, azida sódica al 0,1%. b. Tampón BD IMag™ 1X: diluya el tampón BD IMag™ (10X) (n.º de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o, como alternativa, prepare solución salina tamponada con fosfato, suplementada con BSA al 0,5%, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,09%.* 2. Prepare una suspensión de células individuales del tejido linfoide de interés o prepare células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de sangre anticoagulada, preferiblemente mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando la solución Ficoll-Paque™ de densidad adecuada. Elimine los grupos de células o los restos pasando las células suspendidas por un colador de nailon de 70 µm. 3. Cuente las células y resuspéndalas en tampón de tinción celular a una concentración de 2 x 10e7 células/ml. 4. Añada el anticuerpo IgG1 de ratón (o el cóctel de anticuerpos IgG1 de ratón) a la concentración adecuada e incube en hielo durante 15 minutos.† 5. Lave las células marcadas con un volumen en exceso de tampón BD IMag™ 1X y aspire cuidadosamente TODO el sobrenadante. Para las depleciones, continúe con el paso 6. Para las selecciones positivas, continúe con el paso 17. Depleciones: 6. Mezcle bien las partículas magnéticas BD IMag™ anti-IgG1 de ratón - DM y añada 50 µl de partículas por cada 1 x 10e7 células totales. 7. MEZCLE COMPLETAMENTE. Refrigerar los leucocitos de rata o ratón durante 30 minutos a 6 °C - 12 °C. Incubar las PBMC humanas a temperatura ambiente durante 30 minutos.† 8. Ajustar el volumen de marcaje a 2-8 x 10e7 células/ml con tampón BD IMag™ 1X o medio de cultivo.* 9. Transferir las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm; el volumen máximo añadido no debe exceder 1,0 ml. Colocar este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6-8 minutos. - Para un volumen mayor, transferir las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm; el volumen máximo añadido no debe exceder 3,0 ml. Colocar este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 10. Con el tubo en el imán de separación celular y usando una pipeta Pasteur de vidrio, aspire con cuidado el sobrenadante (fracción agotada) y colóquelo en un tubo nuevo. 11. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue tampón BD IMag™ 1X (o medio) al mismo volumen que en el paso 9. Resuspenda bien el pocillo de la fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces y vuelva a colocarlo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. - Tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 12. Usando una pipeta Pasteur nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción agotada del paso 11 anterior. 13. Repita los pasos 11 y 12. La fracción agotada combinada contiene células sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. Estas células están listas para aplicaciones posteriores, o pueden enriquecerse aún más procediendo al paso 15. 14. Las células de fracción positiva que quedan en el tubo original pueden resuspenderse en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo. 15. Para aumentar la pureza de la fracción agotada combinada, coloque el tubo en el imán de separación celular durante otros 6-8 minutos. - Tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 16. Aspire con cuidado el sobrenadante (la fracción agotada final) y colóquelo en un tubo nuevo. Las células están listas para aplicaciones posteriores. Selecciones positivas: 17. Agite bien las partículas magnéticas BD IMag™ Anti-Mouse IgG1 - DM y añada de 10 a 50 µl de partículas por cada 1 x 10e7 células totales. 18. MEZCLE COMPLETAMENTE. Refrigerar los leucocitos de rata o ratón durante 30 minutos a 6 °C -12 °C. Incube las PBMC humanas a temperatura ambiente durante 30 minutos.† 19. Lleve el volumen de marcaje a una concentración de 2-8 x 10e7 células/ml con tampón BD IMag™ 1X. 20. Coloque inmediatamente el tubo en el imán de separación celular e incube durante 6-8 minutos. 21. Con el tubo en el imán de separación celular, aspire cuidadosamente el sobrenadante. Este sobrenadante se considera la fracción negativa. 22. Retire el tubo del imán de separación celular y agregue tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 19. Resuspenda suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo y regrese el tubo al imán de separación celular durante otros 2-4 minutos. 23. Con el tubo en el imán de separación celular, retire cuidadosamente el sobrenadante. 24. Repita los pasos 22 y 23. 25. Tras el último lavado, retire el tubo del imán de separación celular. Resuspenda la fracción positiva en un tampón o medio de cultivo adecuado y proceda con las aplicaciones posteriores deseadas, incluyendo la citometría de flujo. NOTAS: * Para la depleción de leucocitos de rata, el medio de cultivo tisular suele producir un ligero aumento de la viabilidad y la recuperación, en comparación con el tampón IMag, sin reducir la pureza celular. Dado que las aplicaciones pueden variar, se recomienda a los investigadores realizar una prueba comparativa del medio de cultivo y el tampón IMag para demostrar la ausencia de efectos adversos. † Evite el etiquetado no específico trabajando con rapidez y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Ficoll-Paque es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.