BD, 557987, Kit de enriquecimiento de células NK humanas BD IMag™ - DM

Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869115
Descripción: Descripción El kit de enriquecimiento de células NK humanas BD IMag™ - DM se utiliza para la selección negativa de células Natural Killer (NK) de sangre periférica. El cóctel de enriquecimiento de células NK humanas biotiniladas contiene anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos expresados ​​en eritrocitos, plaquetas y leucocitos periféricos (incluidas las células NK-T) que no son células NK. Las partículas de estreptavidina Plus BD IMag™ - DM son nanopartículas magnéticas que tienen estreptavidina conjugada covalentemente a sus superficies. Con estos dos componentes, el kit de enriquecimiento de células NK humanas BD IMag™ - DM evita la activación accidental de las células NK enriquecidas mediante reactivos que no se unen directamente a dichas células. Este kit de enriquecimiento se ha optimizado para su uso con el imán de separación celular BD IMag™ y contiene suficientes reactivos para marcar 10^9 células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El componente NK Cell Enrichment Cocktail está compuesto por los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con biotina: Anti-CD3 humano, clon UCHT1 Anti-CD19 humano, clon HIB19 Anti-CD36 humano, clon CB38 (NL07) Anti-CD41a humano, clon HIP8 Anti-CD66b humano, clon G10F5 Anti-CD123 humano (cadena α del receptor de IL-3), clon 9F5 Anti-CD235a humano (glicoforina A), clon GA-R2 (HIR2) Anti-IgE humana, clon G7-26
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con biotina en condiciones óptimas y se eliminó la biotina no reaccionada. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: A continuación, se detalla el protocolo de enriquecimiento y marcado magnético. En resumen, el cóctel de enriquecimiento de células NK humanas biotiniladas tiñe simultáneamente eritrocitos, plaquetas y la mayoría de los leucocitos, excepto las células NK. Tras eliminar el exceso de anticuerpos, se añaden BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM a la suspensión celular, que se une a las células que contienen los anticuerpos biotinilados. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca en el campo magnético del imán de separación celular BD IMag™ (n.º de cat. 552311). Se realiza una selección negativa para enriquecer las células NK no marcadas. Las células marcadas migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan extraerse y retenerse (fracción enriquecida). La selección negativa se repite dos veces para aumentar el rendimiento de la fracción enriquecida. Si se requiere una mayor pureza, se puede realizar una selección negativa en la fracción enriquecida. Para aclarar el procedimiento, los pasos de la separación magnética se diagraman en el diagrama de flujo de enriquecimiento. Las fracciones positivas y enriquecidas se pueden evaluar en aplicaciones posteriores, como la citometría de flujo y el cultivo de tejidos. Los anticuerpos del cóctel de enriquecimiento de células NK humanas biotiniladas se han optimizado y prediluido para maximizar la eficiencia en el enriquecimiento de células NK a partir de PBMC. PROTOCOLO DE ETIQUETADO MAGNÉTICO Y ENRIQUECIMIENTO 1. Prepare el tampón BD IMag™ 1X: Diluya el tampón BD IMag™ (10X) (n.° de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1 %. 1. Prepare PBMC a partir de sangre humana anticoagulada, preferiblemente mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque™. 2. Retire los grumos de células o residuos pasando la suspensión a través de un filtro de nailon de 70 µm. Cuente las células y vuelva a suspenderlas en tampón BD IMag™ 1X a una concentración de 10 x 10^6 células/ml. 3. Añada el cóctel de enriquecimiento de células NK humanas biotiniladas a 5 µl por cada 1 x 10^6 células e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.† 4. Lave las células marcadas con un exceso de volumen de tampón BD IMag™ 1X, centrifugue a 300 × g durante 7 minutos y aspire cuidadosamente todo el sobrenadante. 5. Mezcle bien las partículas de estreptavidina BD IMag™ Plus - DM y añada 5 µl de partículas por cada 1 x 10^6 células totales. 6. Mezcle bien. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.† 7. Llevar el volumen de marcado hasta una concentración de 20-80 x 10^6 células/ml con 1X BD IMag buffer. 8. Transferir las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm, el volumen máximo añadido no debe exceder 1,0 ml. Colocar este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos. - Para un mayor volumen, transferir las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm, el volumen máximo añadido no debe exceder 3,0 ml. Colocar este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 9. Con el tubo en el imán de separación celular y utilizando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, aspirar cuidadosamente el sobrenadante (fracción enriquecida) y colocarlo en un nuevo tubo estéril. 10. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 8. Resuspenda bien el pocillo de la fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. - Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 11. Con una pipeta Pasteur estéril nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción enriquecida del paso 10 anterior. 12. Repita los pasos 11 y 12. La fracción enriquecida combinada contiene células NK sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. 13. Para aumentar la pureza de la fracción enriquecida combinada en otro 5 % o más (compare el panel central izquierdo y central derecho en la figura), coloque el tubo que contiene la fracción enriquecida combinada en el imán de separación celular durante otros 6 a 8 minutos. - Para tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 14. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo estéril. Esta es la fracción dos veces enriquecida. Las células están listas para ser procesadas para aplicaciones posteriores. 15. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original se pueden resuspender en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo, si se desea. 16. Las muestras de la suspensión celular total y las fracciones positiva y enriquecida se deben analizar por citometría de flujo para evaluar la eficiencia del procedimiento de separación celular. * Consejos para una preparación celular exitosa: - Extraiga la sangre en un tubo que contenga EDTA - Retire el plasma rico en plaquetas centrifugando una vez a 220-240 × g. - Lave 2-3 veces en PBS después de la separación por gradiente de densidad. - Después del lavado final, resuspenda las células a una concentración relativamente alta en tampón BD IMag™ 1X y proceda al Paso 3. † Evite el etiquetado no específico trabajando rápidamente y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Ficoll-Paque es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos.
Descripción: ID de EntrezGene
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