BD, 558420, Kit de enriquecimiento de células dendríticas humanas BD IMag™ - DM

Reactividad: Humana (Reportada)
Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869175
Descripción: El kit de enriquecimiento de células dendríticas humanas BD IMag™ - DM se utiliza para la selección negativa de células dendríticas (CD) de sangre periférica. El cóctel de enriquecimiento de células dendríticas humanas contiene anticuerpos monoclonales biotinilados que reconocen antígenos expresados ​​en eritrocitos, plaquetas y leucocitos periféricos que no son CD. Las partículas de estreptavidina Plus BD IMag™ - DM son nanopartículas magnéticas que tienen estreptavidina conjugada covalentemente a sus superficies. Con estos dos componentes, el kit de enriquecimiento de células dendríticas humanas BD IMag™ - DM evita la activación accidental de las CD enriquecidas mediante el uso de reactivos que no se unen directamente a dichas CD. Este kit de enriquecimiento se ha optimizado para su uso con el imán de separación celular BD IMag™ y contiene suficientes reactivos para marcar 10e9 células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El cóctel de enriquecimiento de células dendríticas humanas, 5,0 ml, está compuesto por los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con biotina: Biotina de ratón anti-CD3 humano, clon UCHT1 Biotina de ratón anti-CD14 humano, clon M5E2 Biotina de ratón anti-CD19 humano, clon HIB19 Biotina de ratón anti-CD41a humano, clon HIP8 Biotina de ratón anti-CD56 humano, clon B159 Biotina de ratón anti-CD66b humano, clon G10F5 Biotina de ratón anti-CD235a humano (glicoforina A), clon GA-R2 (HIR2) Biotina de ratón anti-IgE humana, clon G7-26
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: A continuación, se detalla el protocolo de enriquecimiento y marcado magnético. En resumen, el cóctel de enriquecimiento de células dendríticas humanas tiñe simultáneamente eritrocitos, plaquetas y la mayoría de los leucocitos, excepto las células dendríticas (CD). Tras eliminar el exceso de anticuerpos, se añaden BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM a la suspensión celular, que se une a las células que contienen los anticuerpos biotinilados. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca en el campo magnético del imán de separación celular BD IMag™ (n.º de cat. 552311). Se realiza una selección negativa para enriquecer las CD no marcadas. Las células marcadas migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan extraerse y retenerse (fracción enriquecida). La selección negativa se repite dos veces para aumentar el rendimiento de la fracción enriquecida. Si se requiere una mayor pureza, se puede realizar una selección negativa en la fracción enriquecida. Para aclarar el procedimiento, los pasos de la separación magnética se diagraman en el diagrama de flujo de enriquecimiento. Las fracciones positivas y enriquecidas se pueden evaluar en aplicaciones posteriores, como la citometría de flujo y el cultivo de tejidos. Los anticuerpos biotinilados del cóctel de enriquecimiento de células dendríticas humanas se han optimizado y prediluido para maximizar la eficiencia en el enriquecimiento de DC a partir de PBMC. PROTOCOLO DE ENRIQUECIMIENTO Y ETIQUETADO MAGNÉTICO 1. Prepare el tampón BD IMag™ 1X: Diluya el tampón BD IMag™ (10X) (n.° de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1 %. 2. Prepare PBMC a partir de sangre humana anticoagulada, preferiblemente mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque™. 3. Retire los grumos de células o residuos pasando la suspensión a través de un filtro de nailon de 70 μm. Cuente las células y resuspéndalas en tampón BD IMag™ 1X a una concentración de 50 x 10⁻¹ células/ml. 4. Añada el cóctel de enriquecimiento de células dendríticas humanas a razón de 5 μl por cada 1 x 10⁻¹ células e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.† 5. Lave las células marcadas con un exceso de volumen de tampón BD IMag™ 1X, centrifugue a 300 × g durante 7 minutos y aspire cuidadosamente todo el sobrenadante. 6. Agite bien las partículas de estreptavidina BD IMag™ Plus - DM y resuspenda el pellet celular en 7,5 μl de partículas por cada 1 x 10⁻¹ células. Tenga en cuenta que este volumen de partículas de estreptavidina IMag es mayor que el utilizado en la mayoría de los sets de enriquecimiento BD IMag y que el set de enriquecimiento de células dendríticas humanas (DM) contiene un mayor volumen total de estas partículas para compensar esta diferencia. 7. MEZCLAR COMPLETAMENTE. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.† 8. Ajustar el volumen de marcaje a una concentración de 20 a 80 x 10⁻¹ células/ml con tampón BD IMag™ 1X. 9. Transferir las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm; el volumen máximo añadido no debe superar 1,0 ml. Colocar este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos. • Para un mayor volumen, divida las células en varios tubos de ensayo de fondo redondo de 12 X 75 mm o transfiera las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm, el volumen máximo añadido no debe exceder los 3,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 10. Con el tubo en el imán de separación celular y usando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, aspire cuidadosamente el sobrenadante (fracción enriquecida) y colóquelo en un nuevo tubo estéril. 11. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 8. Resuspenda bien el pocillo de fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces (evite crear burbujas) y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. • Para el tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 12. Utilizando una pipeta Pasteur estéril nueva, aspire cuidadosamente el sobrenadante y combínelo con la fracción enriquecida del paso 10 anterior. 13. Repita los pasos 11 y 12. La fracción enriquecida combinada contiene células dendríticas sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. 14. Para aumentar la pureza de la fracción enriquecida combinada, coloque el tubo que contiene la fracción enriquecida combinada en el imán de separación celular durante otros 10 minutos. • Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 10 minutos. 15. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo estéril. Esta es la fracción dos veces enriquecida. Las células están listas para ser procesadas para aplicaciones posteriores. 16. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original se pueden resuspender en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo, si se desea. 17. Las muestras de la suspensión celular total y las fracciones positivas y enriquecidas deben analizarse mediante citometría de flujo para evaluar la eficacia del procedimiento de separación celular. NOTAS: • Extraer la sangre en un tubo con EDTA. • Extraer el plasma rico en plaquetas centrifugando una vez a 220-240 × g. • Lavar 2-3 veces en PBS después de la separación por gradiente de densidad. • Tras el lavado final, resuspender las células a una concentración relativamente alta en tampón BD IMag™ 1X y continuar con el paso 3. † Evitar el marcaje inespecífico trabajando con rapidez y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA, ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Ficoll-Paque es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
Descripción: ID de EntrezGene
N/D : N/D