BD, 558454, BD IMag™ Conjunto de enriquecimiento de monocitos humanos - DM

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869179
Descripción: El kit de enriquecimiento de monocitos humanos BD IMag™ - DM se utiliza para la selección negativa de monocitos de sangre periférica. El kit de enriquecimiento de monocitos humanos (componente 51-9004592) contiene anticuerpos monoclonales biotinilados que reconocen antígenos expresados ​​en eritrocitos y leucocitos periféricos. El kit consta de los siguientes anticuerpos antihumanos conjugados con biotina: CD3 (clon UCHT1), CD45RA (clon HI100), CD19 (clon HIB19), CD56 (clon B159) y CD235a (GA-R2). También se incluye un reactivo adicional (componente 51-9004594), anticuerpo anti-CD41a humano con biotina de ratón, que ofrece a los investigadores la opción de eliminar plaquetas. Las plaquetas tienden a adherirse a los monocitos y, por lo tanto, la adición de CD41a puede reducir la producción de monocitos tras el enriquecimiento. Sin embargo, la población monocítica resultante será más pura que sin la adición del anticuerpo anti-CD41a humano. Las partículas de estreptavidina BD IMag™ Plus - DM (componente 51-9000810) son nanopartículas magnéticas con estreptavidina conjugada covalentemente a sus superficies. El kit de enriquecimiento de monocitos humanos BD IMag™ - DM se ha optimizado para su uso con el imán de separación celular BD IMag™ y contiene suficientes reactivos para marcar 10e9 células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: En resumen, al añadir el cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos a la muestra, se tiñen simultáneamente los eritrocitos y la mayoría de los leucocitos, lo que da como resultado una población enriquecida de monocitos. La adición del anticuerpo anti-CD41a humano de ratón con biotina (opcional) permitirá la eliminación de plaquetas. Tras eliminar el exceso de anticuerpos, se añaden BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM a la suspensión celular, que se une a las células que contienen los anticuerpos biotinilados. El tubo que contiene la suspensión celular marcada se coloca dentro del campo magnético del imán de separación celular BD IMag™. Se realiza una selección negativa para enriquecer los monocitos no marcados. Las células marcadas con estreptavidina migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan extraerse y retenerse (fracción enriquecida). La selección negativa se repite dos veces para aumentar el rendimiento de la fracción enriquecida. Si se requiere mayor pureza, se puede realizar una selección negativa en la fracción enriquecida. El procedimiento de separación magnética descrito se representa gráficamente en el diagrama de flujo de enriquecimiento. Los anticuerpos biotinilados del cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos se han optimizado y prediluido para maximizar la eficiencia en el enriquecimiento de monocitos a partir de PBMC. PROTOCOLO DE ENRIQUECIMIENTO Y MARCAJE MAGNÉTICO 1. Prepare el tampón BD IMag™ 1X: Diluya el tampón BD IMag™ (10X) (n.° de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1 %. 2. Prepare PBMC a partir de sangre humana anticoagulada, preferiblemente mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque™.* 3. Retire los grumos de células o residuos pasando la suspensión a través de un filtro de nailon de 70 µm. Cuente las células y resuspéndalas en tampón BD IMag™ 1X a una concentración de 10 x 10⁻¹ células/ml. 4. Añada el cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos a 5 µl por 1 x 10⁻¹ células e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.† Opcional: Añada el anticuerpo anti-CD41a humano con biotina de ratón a 5 µl por 1 x 10⁻¹ células. 5. Lave las células marcadas con un exceso de volumen de 10X de tampón BD IMag™ 1X, centrifugue a 300 ×g durante 7 minutos y aspire cuidadosamente todo el sobrenadante. 6. Agite bien el BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM y resuspenda el pellet celular en 5 µl de partículas por cada 1 x 10⁻¹ células. 7. Mezcle bien. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.† 8. Aumente el volumen de marcaje a 20-80 x 10⁻¹ células/ml con tampón BD IMag™ 1X. 9. Transfiera las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm; el volumen máximo añadido no debe exceder 1,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva sobre el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos. Para un volumen mayor, transfiera las células a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm; el volumen máximo añadido no debe exceder 3,0 ml. Coloque este tubo de fracción positiva en el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 10. Con el tubo en el imán de separación celular y usando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, aspire con cuidado el sobrenadante (fracción enriquecida) y colóquelo en un nuevo tubo estéril. 11. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 8. Resuspenda bien el pocillo de fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. -Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 12. Usando una pipeta Pasteur estéril nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción enriquecida del paso 10 anterior. 13. Repita los pasos 11 y 12. La fracción enriquecida combinada contiene monocitos sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. 14. Para aumentar la pureza de la fracción enriquecida combinada en otro 5 % o más (compare los paneles medio izquierdo y medio derecho en la figura), coloque el tubo que contiene la fracción enriquecida combinada en el imán de separación celular durante otros 10 minutos. -Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 10 minutos. 15. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo estéril. Esta es la fracción dos veces enriquecida. Las células están listas para ser procesadas para aplicaciones posteriores. 16. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original se pueden resuspender en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo, si se desea. 17. Las muestras de la suspensión celular total y las fracciones positiva y enriquecida deben analizarse mediante citometría de flujo para evaluar la eficiencia del procedimiento de separación celular. NOTAS: * Consejos para una preparación celular exitosa: Extraiga la sangre en un tubo con EDTA. Retire el plasma rico en plaquetas centrifugando una vez a 220-240 × g. Lave 2-3 veces en PBS después de la separación por gradiente de densidad. Después del lavado final, resuspenda las células a una concentración relativamente alta en tampón BD IMag™ 1X y continúe con el paso 3. † Evite el marcaje inespecífico trabajando con rapidez y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Ficoll-Paque es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
Descripción: ID de EntrezGene
N/D : N/D