BD, 560030, BD IMag™ Conjunto de depleción celular de linaje humano - DM

Aplicación: Separación de células (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869285
Descripción: Descripción El BD IMag™ Human Lineage Cell Depletion Set - DM se utiliza para la depleción de células hematopoyéticas maduras, como células T, células B, células NK, plaquetas, monocitos, granulocitos y células eritroides, a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), médula ósea y muestras de sangre del cordón umbilical. Esto permite enriquecer poblaciones celulares raras, como células madre, células progenitoras y células dendríticas. El Human Lineage Cell Depletion Cocktail contiene anticuerpos monoclonales biotinilados que reconocen antígenos expresados ​​en células T, células B, células NK, monocitos, granulocitos, plaquetas y células eritroides. Las BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM son nanopartículas magnéticas que tienen estreptavidina conjugada covalentemente a sus superficies. Con estos dos componentes, el kit de depleción celular de linaje humano BD IMag™ - DM puede utilizarse como herramienta de enriquecimiento primario o como herramienta de clasificación preflujo para el enriquecimiento de poblaciones celulares raras. Como herramienta de clasificación citométrica preflujo, puede reducir drásticamente el tiempo de clasificación, además de aumentar la recuperación de las células de interés. Este kit de depleción celular de linaje humano ha sido optimizado para su uso con el imán de separación celular BD IMag™ y contiene suficientes reactivos para marcar 1 x 10^9 células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El cóctel de depleción de linaje humano se compone de los siguientes anticuerpos monoclonales biotinilados: Biotina de ratón anti-CD3 humano, clon UCHT1 Biotina de ratón anti-CD14 humano, clon M5E2 Biotina de ratón anti-CD16 humano, clon 3G8 Biotina de ratón anti-CD19 humano, clon HIB19 Biotina de ratón anti-CD41a humano, clon HIP8 Biotina de ratón anti-CD56 humano, clon B159 Biotina de ratón anti-Glicoforina A humana, clon GA-R2
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con biotina en condiciones óptimas y se eliminó la biotina no reaccionada. El anticuerpo o la estreptavidina se conjugaron con las partículas magnéticas en condiciones óptimas y se eliminó el anticuerpo/estreptavidina no conjugado.
Procedimientos de ensayo recomendados: A continuación, se detalla el protocolo de enriquecimiento y marcado magnético. En resumen, el cóctel de depleción celular de linaje humano tiñe simultáneamente células T, B y NK, monocitos, granulocitos, plaquetas y células eritroides. Tras eliminar el exceso de anticuerpos, se añaden BD IMag™ Streptavidin Particles Plus - DM a la suspensión celular, que se une a las células que contienen los anticuerpos biotinilados. El tubo que contiene esta suspensión celular marcada se coloca en el campo magnético del imán de separación celular (n.º de cat. 552311). Se realiza una selección negativa para enriquecer las células madre y progenitoras no marcadas. Las células marcadas migran hacia el imán (fracción positiva), dejando las células no marcadas en suspensión para que puedan extraerse y retenerse (fracción enriquecida). La selección negativa se repite dos veces para aumentar el rendimiento de la fracción enriquecida. Si se requiere una mayor pureza, se puede realizar una selección negativa en la fracción enriquecida. Para aclarar el procedimiento, los pasos de la separación magnética se esquematizan en el diagrama de flujo de enriquecimiento. Las fracciones positivas y enriquecidas pueden evaluarse en aplicaciones posteriores, como la citometría de flujo y el cultivo de tejidos. Los anticuerpos biotinilados del cóctel de depleción celular de linaje humano se han optimizado y prediluido para maximizar la eficiencia en el enriquecimiento de células de poblaciones raras, como las células madre de PBMC. PROTOCOLO DE ENRIQUECIMIENTO Y MARCAJE MAGNÉTICO 1. Prepare el tampón BD IMag™ 1X: Diluya el tampón BD IMag™ (10X) (n.° de cat. 552362) 1:10 con agua destilada estéril o prepare solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM y azida sódica al 0,1 %. 2. Prepare PBMC a partir de sangre humana anticoagulada con EDTA, preferiblemente mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque™.* 3. Cuente las células y resuspéndalas en tampón BD IMag™ 1X a una concentración de 50 x 10^6 células/ml. 4. Añada el cóctel de depleción celular de linaje humano a 5 µl por millón de células e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.† 5. Lave las células marcadas con un exceso de volumen 10X de tampón BD IMag™ 1X, centrifugue a 300 xg durante 10 minutos y aspire cuidadosamente TODO el sobrenadante. 6. Mezcle bien con vórtex las partículas de estreptavidina BD IMag™ Plus - DM y resuspenda el pellet celular en una concentración de 7,5 µl de partículas/1 x 10^6 células. Tenga en cuenta que este volumen de partículas de estreptavidina IMag es mayor que el utilizado en la mayoría de los sets de enriquecimiento BD IMag y que este set contiene un mayor volumen total de estas partículas para compensar esta diferencia. 7. MEZCLE COMPLETAMENTE. Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.† 8. Lleve el volumen de marcaje a una concentración de 10-80 10^6 células/ml con tampón BD IMag™ 1X. 9. Transfiera las células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm; el volumen máximo añadido no debe exceder 1,0 ml. Coloque este tubo en el imán de separación celular (posición horizontal) durante 6 a 8 minutos. -Para un mayor volumen, divida las células en varios tubos de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm o transfiéralas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 17 x 100 mm; el volumen máximo añadido no debe exceder 3,0 ml. Coloque este tubo en el imán de separación celular (posición vertical) durante 8 minutos. 10. Con el tubo en el imán de separación celular y usando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, aspire con cuidado el sobrenadante (fracción enriquecida) y colóquelo en un nuevo tubo estéril. 11. Retire el tubo de fracción positiva del imán de separación celular y agregue tampón BD IMag™ 1X al mismo volumen que en el paso 8. Resuspenda bien el pocillo de fracción positiva pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces (evite crear burbujas) y vuelva a colocar el tubo en el imán de separación celular durante 6 a 8 minutos. - Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 8 minutos. 12. Usando una pipeta Pasteur estéril nueva, aspire con cuidado el sobrenadante y combínelo con la fracción enriquecida del paso 10 anterior. 13. Repita los pasos 11 y 12. La fracción enriquecida combinada contiene células no pertenecientes al linaje sin anticuerpos unidos ni partículas magnéticas. 14. Para aumentar la pureza de la fracción enriquecida combinada, coloque el tubo que contiene la fracción enriquecida combinada en el imán de separación celular durante otros 3 a 10 minutos. Un mayor tiempo de imán aumentará la pureza, pero disminuirá la recuperación. -Para un tubo de 17 x 100 mm: Colóquelo en el imán de separación celular durante 6 a 10 minutos. 15. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo estéril. Esta es la fracción no perteneciente al linaje dos veces enriquecida. Las células están listas para ser procesadas para aplicaciones posteriores. 16. Las células de la fracción positiva que quedan en el tubo original pueden resuspenderse en un tampón o medio de cultivo adecuado para aplicaciones posteriores, incluida la citometría de flujo, si se desea. 17. Las muestras de la suspensión celular total, las fracciones positiva y enriquecida deben analizarse mediante citometría de flujo para evaluar la eficiencia del procedimiento de separación celular. NOTAS: * Consejos para una preparación exitosa de células: - Extraiga la sangre en un tubo que contenga EDTA. - Retire el plasma rico en plaquetas centrifugando una vez a 220-240 x g. - Lave 2-3 veces en PBS después de la separación por gradiente de densidad. - Después del lavado final, resuspenda las células a una concentración relativamente alta en tampón BD IMag™ 1X y proceda al paso 3. † Evite el etiquetado no específico trabajando rápidamente y respetando los tiempos de incubación recomendados.
Avisos del producto: Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA, ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Las partículas BD IMag™ se preparan a partir de partículas magnéticas carboxifuncionalizadas, fabricadas por Skold Technology y con licencia de patente estadounidense número 7,169,618. Ficoll-Paque es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
Descripción: ID de EntrezGene
N/D : N/D