BD, 563503, tampón de preclasificación BD FACS™

Preparación y almacenamiento: Conservar a -20 °C, protegido de la luz. Esta preparación no contiene conservantes, por lo que debe manipularse en condiciones asépticas. Descongelar completamente a 4 °C antes del primer uso. Distribuir alícuotas de 25 ml (o el volumen deseado de un solo uso) de tampón completo en recipientes estériles y conservar a -20 °C. El tampón completo es estable a -20 °C durante 6 meses. Cada alícuota debe considerarse de un solo uso y utilizarse completamente el día de la descongelación para garantizar una actividad óptima (evitar múltiples ciclos de congelación/descongelación).
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Citometría de flujo (tinción de inmunofluorescencia directa): 1. Descongele completamente su alícuota de tampón de preclasificación BD FACS™ a 4 °C. 2. Prepare suspensiones de células individuales de tejido, médula ósea, sangre periférica o cultivos celulares utilizando protocolos estándar. 3. Lave las células dos veces en tampón de preclasificación completo frío. Resuspenda el sedimento celular con tampón de preclasificación frío hasta una concentración final de ~1 x 10e7 células/ml. a. Si es necesario, diluya los anticuerpos fluorescentes a sus concentraciones óptimas predeterminadas en tampón de preclasificación completo. 4. Agregue la cantidad apropiada de anticuerpo conjugado a la suspensión celular. Incube durante 20 minutos en hielo protegido de la luz. a. El tiempo de tinción puede aumentarse (≥ 45 min) dependiendo de la avidez del anticuerpo conjugado fluorescentemente. 5. Lave las células dos veces con tampón de preclasificación completo. Centrifugue las células a 300 xg durante 5 min. Después de cada centrifugación, aspire o invierta cuidadosamente y elimine los sobrenadantes de los pellets celulares. 6. Resuspenda el pellet celular en tampón de preclasificación completo y transfiera las células teñidas a los tubos apropiados para el análisis y/o la clasificación por citometría de flujo (p. ej., ajuste el volumen final para proporcionar ~5 x 10e6 células/ml). 7. Clasifique inmediatamente las células según un protocolo de clasificación optimizado. Nota 1: Se puede agregar DNasa II al tampón de preclasificación para ayudar a desalentar la aglutinación de suspensiones celulares que tienen una alta cantidad de muerte celular. La presencia de ADN libre en la suspensión celular puede contribuir a la aglutinación celular. La DNasa I no es compatible con el tampón de preclasificación debido a la necesidad de cationes para que la DNasa I funcione. La DNasa II contiene niveles de endotoxina y pueden variar según el lote. Dependiendo de su aplicación, es posible que desee agregar DNasa II al tampón de preclasificación. Sin embargo, es posible que también deba determinar si los niveles de endotoxina son apropiados para su aplicación. Nota 2: El tampón de preclasificación no contiene antibióticos. Se pueden agregar antibióticos al tampón de preclasificación según corresponda. Nota 3: El tampón de preclasificación se puede usar de manera similar para la tinción inmunofluorescente indirecta de células. En este caso, repita los pasos 4 y 5 con los reactivos del segundo paso cuando use anticuerpos primarios no marcados o biotinilados. Nota 4: El tampón de preclasificación también se puede usar para la tinción inmunofluorescente de antígenos de superficie expresados ​​por células que están destinadas a ser fijadas y teñidas inmunofluorescentemente para antígenos intracelulares como citocinas y factores de transcripción. Las células teñidas para antígenos intracelulares se pueden resuspender y mantener (es decir, a 4 °C, protegidas de la luz) en el tampón de preclasificación antes del análisis por citometría de flujo. Nota 5: El tampón de preclasificación no es un tampón de recolección posterior a la clasificación. Recoja las células en un tampón o medio adecuado para las aplicaciones posteriores. Nota 6: El tampón de preclasificación es compatible con los colorantes de viabilidad de uso común, como el 7-AAD.
Avisos del producto: Consulte los protocolos técnicos en www.bdbiosciences.com/us/s/resources. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Accutase es una marca registrada de Innovative Cell Technologies, Inc. Ficoll-Paque es una marca registrada de Amersham Biosciences Limited. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA, ubicados en Estados Unidos.