BD, 556570, Kit de detección de apoptosis con anexina V FITC de BD Pharmingen™ II

Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869085
Descripción: Descripción La apoptosis es un proceso fisiológico normal que ocurre durante el desarrollo embrionario, así como en el mantenimiento de la homeostasis tisular. El programa apoptótico se caracteriza por ciertas características morfológicas, incluyendo la pérdida de asimetría y unión de la membrana plasmática, la condensación del citoplasma y el núcleo, y la escisión internucleosomal del ADN. La pérdida de la membrana plasmática es una de las características más tempranas. En las células apoptóticas, el fosfolípido de membrana fosfatidilserina (PS) se transloca desde la lámina interna a la externa de la membrana plasmática, exponiendo así la PS al entorno celular externo. La anexina V es una proteína de unión a fosfolípidos dependiente de Ca2+ de 35-36 kDa que tiene una alta afinidad por la PS y se une a las células con PS expuesta. La anexina V puede conjugarse con fluorocromos, incluyendo FITC. Este formato conserva su alta afinidad por la PS y, por lo tanto, sirve como una sonda sensible para el análisis de citometría de flujo de células que están experimentando apoptosis. Dado que la externalización de PS ocurre en las primeras etapas de la apoptosis, la tinción con FITC Anexina V puede identificar la apoptosis en una etapa más temprana que los ensayos basados ​​en cambios nucleares como la fragmentación del ADN. La tinción con FITC Anexina V precede a la pérdida de integridad de la membrana que acompaña a las últimas etapas de la muerte celular resultante de procesos apoptóticos o necróticos. Por lo tanto, la tinción con FITC Anexina V se usa típicamente junto con un colorante vital como el yoduro de propidio (PI) o 7-amino-actinomicina (7-AAD) para permitir al investigador identificar células apoptóticas tempranas (PI negativas, FITC Anexina V positivas). Las células viables con membranas intactas excluyen PI, mientras que las membranas de las células muertas y dañadas son permeables a PI. Por ejemplo, las células que se consideran viables son FITC Anexina V y PI negativas; las células que están en apoptosis temprana son FITC Anexina V positivas y PI negativas; y las células que están en apoptosis tardía o ya muertas son tanto FITC Anexina V como PI positivas. Este ensayo no distingue entre células que han sufrido muerte apoptótica frente a las que han muerto como resultado de una vía necrótica porque en cualquier caso, las células muertas se teñirán tanto con anexina-FITC como con PI. Sin embargo, cuando se mide la apoptosis a lo largo del tiempo, a menudo se pueden rastrear las células desde FITC anexina V y PI negativas (viables o sin apoptosis medible), hasta FITC anexina V positivas y PI negativas (apoptosis temprana, integridad de la membrana presente) y finalmente a FITC anexina V y PI positivas (apoptosis en etapa final y muerte). El movimiento de las células a través de estas tres etapas sugiere apoptosis. Por el contrario, una sola observación que indique que las células son tanto FITC anexina V como PI positivas, en sí misma, revela menos información sobre el proceso por el cual las células experimentaron su desaparición.
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. Conservar todos los componentes, excepto la anexina V recombinante (componente n.° 51-65871A), a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. Conservar la anexina V recombinante (componente n.° 51-65871A) a -80 °C, evitando ciclos repetidos de congelación/descongelación para minimizar el riesgo de degradación de las proteínas.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados La anexina V de FITC es una sonda sensible para identificar células apoptóticas, que se une a superficies de fosfolípidos con carga negativa (Kd de ~5 x 10^-2) con una mayor afinidad por la fosfatidilserina (PS) que la mayoría de los demás fosfolípidos. La unión de la anexina V de FITC depende del calcio y se requieren concentraciones definidas de calcio y sal para una tinción óptima, como se describe en el Protocolo de tinción de anexina V de FITC. Los investigadores deben tener en cuenta que el análisis citométrico de flujo de la anexina V de FITC en tipos de células adherentes (p. ej., HeLa, NIH 3T3, etc.) no se prueba de forma rutinaria, ya que puede producirse un daño específico de la membrana durante el desprendimiento o la recolección de células. Sin embargo, se han informado previamente métodos para utilizar la anexina V para citometría de flujo en tipos de células adherentes (Casiola-Rosen et al. y van Engelend et al.). INDUCCIÓN DE APOPTOSIS POR CAMPTOTECINA El siguiente protocolo se proporciona como una ilustración de cómo se puede utilizar FITC Annexin V en una línea celular (Jurkat). Materiales 1. Prepare la solución madre de camptotecina (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 mM en DMSO. 2. Células T Jurkat (ATCC TIB-152). Procedimiento 1. Añada camptotecina (concentración final 4-6 µM) a 1 x 10^6 células Jurkat. 2. Incube las células durante 4-6 horas a 37 °C. 3. Proceda con el protocolo de tinción de FITC Annexin V para medir la apoptosis. PROTOCOLO DE TINCIÓN Y BLOQUEO DE FITC Annexin V FITC Annexin V se utiliza para determinar cuantitativamente el porcentaje de células dentro de una población que están experimentando apoptosis activamente. Se basa en la propiedad de las células de perder la asimetría de la membrana en las fases tempranas de la apoptosis. En las células apoptóticas, el fosfolípido de membrana fosfatidilserina (PS) se transloca desde la lámina interna de la membrana plasmática a la lámina externa, exponiendo así la PS al ambiente externo. La anexina V es una proteína de unión a fosfolípidos dependiente del calcio que tiene una alta afinidad por la PS y es útil para identificar células apoptóticas con PS expuesta. El yoduro de propidio (PI) es una sonda de viabilidad citométrica de flujo estándar y se utiliza para distinguir las células viables de las no viables. Las células viables con membranas intactas excluyen el PI, mientras que las membranas de las células muertas y dañadas son permeables al PI. Las células que se tiñen positivamente para la anexina V de FITC y negativas para el PI están en apoptosis. Las células que se tiñen positivamente tanto para la anexina V de FITC como para el PI están en la etapa final de la apoptosis, están en necrosis o ya están muertas. Las células con tinción negativa para FITC Anexina V y PI están vivas y no experimentan apoptosis medible. Reactivos: 1. FITC Anexina V (componente n.° 51-65874X): Utilizar 5 µl por prueba. 2. El yoduro de propidio (PI) (componente n.° 51-66211E) es un colorante de ácidos nucleicos práctico y listo para usar. Utilizar 5 µl por prueba. 3. Tampón de unión de anexina V 10X (componente n.° 51-66121E): Hepes/NaOH 0,1 M (pH 7,4), NaCl 1,4 M, CaCl₂ 25 mM. Para obtener una solución de trabajo 1X, diluir 1 parte del tampón de unión de anexina V 10X en 9 partes de agua destilada. 4. Anexina V recombinante purificada (componente n.° 51-65871A): Utilizar de 5 a 15 µg por prueba. Se recomienda a los investigadores titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Tinción: 1. Lavar las células dos veces con PBS frío y resuspenderlas en tampón de unión 1X a una concentración de 1 x 10^6 células/ml. 2. Transferir 100 µl de la solución (1 x 10^5 células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Añadir 5 µl de anexina V FITC y 5 µl de PI. 4. Agitar suavemente las células e incubar durante 15 min a temperatura ambiente (25 °C) en oscuridad. 5. Añadir 400 µl de tampón de unión 1X a cada tubo. Analizar mediante citometría de flujo en 1 h. Bloqueo Como control opcional, los investigadores pueden preincubar muestras celulares con anexina V recombinante purificada (componente n.º 51-65871A). Al bloquear los sitios de unión de la anexina V de FITC, se puede demostrar la unión específica de la anexina V de FITC como se ilustra en la figura. 1. Lave las células dos veces con PBS frío y luego resuspenda las células en tampón de unión 1X a una concentración de 1 x 10^6 células/ml. 2. Transfiera 100 µl de la solución (1 x 10^5 células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Agregue 5-15 µg de anexina V recombinante purificada. La cantidad de anexina V recombinante purificada necesaria para saturar los sitios de unión puede variar según el tipo de célula y la etapa de apoptosis. En algunos casos, los investigadores pueden necesitar reducir el número de células a 0,5 x 10^5 y aún agregar 5-15 µg de anexina V recombinante para obtener resultados óptimos. Se recomienda encarecidamente la titulación. 4. Agite suavemente las células e incube durante 15 min a temperatura ambiente. 5. Añada 5 µl de FITC Annexin V y 5 µl de PI. 6. Agite suavemente las células e incube durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. 7. Añada 400 µl de tampón de unión 1X a cada tubo. Analice por citometría de flujo lo antes posible (en 1 hora). CONTROLES SUGERIDOS PARA CONFIGURAR LA CITOMETRÍA DE FLUJO Los siguientes controles se utilizan para configurar la compensación y los cuadrantes: 1. Células sin teñir. 2. Células teñidas con FITC Annexin V (sin PI). 3. Células teñidas con PI (sin FITC Annexin V). Otros controles de tinción: Se debe utilizar una línea celular que pueda inducirse fácilmente a sufrir apoptosis para obtener una tinción de control positiva con FITC Annexin V y/o FITC Annexin V y PI. Es importante destacar que el nivel basal de apoptosis y necrosis varía considerablemente dentro de una población. Por lo tanto, incluso en ausencia de apoptosis inducida, la mayoría de las poblaciones celulares contendrán un pequeño porcentaje de células con apoptosis positiva (FITC Anexina V positiva, IP negativa o FITC Anexina V positiva, IP positiva). La población no tratada se utiliza para definir el nivel basal de células apoptóticas y muertas. El porcentaje de células que han sido inducidas a apoptosis se determina restando el porcentaje de células apoptóticas en la población no tratada del porcentaje de células apoptóticas en la población tratada. Dado que la muerte celular es el resultado final de las células en apoptosis, las células en las últimas etapas de la apoptosis tendrán una membrana dañada y se tiñerán positivamente tanto para IP como para FITC Anexina V. Por lo tanto, el ensayo no distingue entre células que ya han sufrido muerte celular apoptótica y aquellas que han muerto como resultado de la vía necrótica, ya que en ambos casos las células muertas se tiñerán tanto con FITC Anexina V como con IP.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
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