BD, 557764, BD™ DimerX DimerX I: proteína de fusión CD1d:Ig humana dimérica soluble recombinante

Isotipo: IgG1 de ratón, λ
Aplicación: ELISA (probado rutinariamente), citometría de flujo (probado durante el desarrollo)
Concentración: 0,5 mg/ml
ID de registro: AB_2869093
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C. La proteína de fusión CD1d:Ig humana se expresó junto con β2M humana en la línea celular de plasmocitoma de ratón J558L (ATCC TIB-6). Las cadenas polipeptídicas CD1d y β2M se asocian de forma no covalente como consecuencia de su coexpresión en las células J558L. La proteína de fusión CD1d:Ig se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular mediante cromatografía de afinidad. La pureza de la preparación se confirmó mediante SDS-PAGE. Además, se añadió β2M humana al reactivo. La proteína de fusión CD1d:Ig humana se analiza mediante ELISA para verificar su identidad.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Es necesario cargar las porciones CD1d de la proteína dimérica con un antígeno relevante de interés antes de la tinción inmunofluorescente de las células NKT. Los complejos CD1d:Ig se cargan eficazmente mediante la incubación con un exceso de antígenos relevantes (específicos) o irrelevantes (control) (véase el Protocolo 1). Se puede utilizar CD1d:Ig cargado con antígeno para la tinción inmunofluorescente (véase el Protocolo 2). Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe determinar las diluciones apropiadas para su uso individual. Protocolo 1: Carga de antígeno de la proteína dimérica CD1d:Ig Se han descrito varios protocolos de carga de antígeno. El método recomendado en BD Biosciences Pharmingen implica la carga pasiva de un exceso de antígeno en solución con la proteína CD1d:Ig. Hemos descubierto que la carga pasiva funciona particularmente bien en el caso de antígenos de alta afinidad. Para antígenos de menor afinidad, un aumento en la razón molar de antígeno a proteína dímera puede mejorar la carga, según lo determinado por análisis de citometría de flujo basado en resultados para otros productos DimerX de BD Pharmingen. Se sugiere que para cada antígeno, parámetros como la dosis de CD1d:Ig por millón de células, razón molar de antígeno a CD1d:Ig y tiempo de carga del antígeno sean determinados empíricamente por el investigador. Preparación y carga del antígeno: 1. Será necesario determinar el peso molecular (PM) de un antígeno de interés. El PM de a-GalCer es 858 daltons. 2. Mezcle la proteína CD1d:Ig con antígeno específico o de control en un exceso molar (M) de 10, 20 o 40. Se puede utilizar el siguiente cálculo, usando α-GalCer como ejemplo: Dg = Peso molecular del antígeno: p. ej., 858 daltons. DCD1d = Peso molecular de CD1d:Ig = 250.000 daltons. R = razón molar de exceso deseada, p. ej., 40. Mg = microgramos (µg) de antígeno de interés. MCD1d = microgramos (µg) de CD1d:Ig en la reacción. Una cantidad típica de CD1d:Ig con carga de antígeno para la tinción por citometría de flujo es de 0,25 a 4 µg/millón de células (prueba). Mg = MCD1d x R x Dg = 4 µg x 40 x 858 d = 0,55 µg de DCD1d 250.000 d Por lo tanto, se añadirían 0,55 µg de antígeno y 4 µg de CD1d:Ig en solución para una carga de antígeno óptima de CD1d:Ig. 3. Mezcle el antígeno y CD1d:Ig en PBS, pH 7,2, e incube a 37 °C durante la noche. El CD1d:Ig cargado con antígeno puede conservarse a 4 °C hasta una semana. *NOTA: Los derechos de α-GalCer pertenecen a Kirin Brewery. La molécula de α-GalCer y sus derivados están protegidos por la patente estadounidense n.º 5.936.076. No se otorga ninguna licencia implícita para el uso de α-GalCer. Protocolo 2: Tinción inmunofluorescente. Protocolo 1. Resuspenda las PBMC o las células diana en el tampón de tinción FACS [p. ej., tampón de tinción BD Pharmingen™ con BSA, n.º de cat. 554657], a una concentración aproximada de 10 e6 células por 50 µl. Añadir ~1 x 10e6 células por tubo de tinción (p. ej., tubo de 12 x 75 mm, BD Falcon™, n.º de cat. 352008). 2. Preparar la mezcla de tinción de la proteína CD1d:Ig cargada con antígeno mezclando 0,25-4 µg de proteína/prueba CD1d:Ig cargada con antígeno con 0,25-4 µg de mAb A85-1 conjugado con PE (anti-IgG1 de ratón, n.º de cat. 550083)/prueba en una proporción de 1:1 o 1:2 de dímero: mAb A85-1. Incubar la mezcla durante 60 minutos a temperatura ambiente, proteger de la exposición a la luz. 3. Añadir 1-2 µg de mAb A111-3 de control de isotipo de IgG1 de ratón purificado (n.º de cat. 553485)/prueba a la mezcla de tinción (véase el paso 2 anterior). Incubar el cóctel de tinción durante 30 minutos a temperatura ambiente, proteger de la exposición a la luz. 4. Preparar IgG humana policlonal purificada a aproximadamente 0,2 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2. 5. Añadir 10 µl (2 µg) de stock de IgG humana por tubo para bloquear la unión no específica de DimerX I o reactivos de anticuerpos a los receptores Fc de superficie. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente. 6. Añadir 50 µl de tampón FACS que contenga la cantidad óptima por prueba del cóctel de tinción, más cualquier otro anticuerpo específico del marcador de superficie celular que se vaya a utilizar en cada muestra. 7. Lavar las células 1x con 2 ml de tampón FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 xg y aspirar el sobrenadante. Resuspender en tampón FACS y analizar por citometría de flujo. Protocolo 3: Alternativa: Tinción inmunofluorescente Protocolo 1. Resuspender las PBMC o células diana en tampón de tinción FACS [p. ej., DPBS, 1 % FCS, 0,09 % NaN3 o tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS), n.º de cat. 554656] a una concentración aproximada de 10 e6 células por 50 µl. Añadir ~1 x 10 e6 células por tubo de tinción (p. ej., tubo de 12 x 75 mm, BD Falcon™ n.º de cat. 352008). 2. Preparar IgG humana policlonal purificada a aproximadamente 0,2 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2. 3. Añadir 10 µl (2 µg) de solución madre de IgG humana por tubo para bloquear la unión no específica de DimerX I o reactivos de anticuerpos a los receptores Fc de superficie. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente. 4. Añadir de 0,25 a 4 µg de proteína CD1d:Ig cargada con antígeno a la suspensión celular. Incubar 60 minutos a 4 °C. 5. Lavar las células una vez con 2 ml de tampón FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 xg y desechar el sobrenadante. 6. Añadir de nuevo 10 µl (2 µg) de IgG humana policlonal purificada por muestra. 7. Resuspender las células en 100 µl de tampón FACS que contenga el reactivo secundario fluorescente diluido adecuadamente. Normalmente utilizamos mAb A85-1 conjugado con PE (anti-IgG1 de ratón, n.º de cat. 550083). Incubar de 30 a 60 minutos a 4 °C. 8. Lavar las células una vez con 2 ml de tampón FACS, centrifugar durante 5 minutos a 250 xg y desechar el sobrenadante. 9. Repita los pasos 7 y 8 para marcar los marcadores de superficie celular con el anticuerpo conjugado con fluorocromo adecuado (evite los anticuerpos con isotipos IgG1 de ratón para reducir el fondo). 10. Resuspenda el sedimento celular en aproximadamente 0,5 ml de tampón de tinción en un tubo adecuado para el citómetro de flujo y analice.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías.