BD, 558710, BD Pharmingen™ Alexa Fluor® 647 Ratón anti-PARP escindido (Asp 214)

Nombre alternativo: Asp214
Reactividad: Humana (prueba de control de calidad), Ratón (probado en desarrollo)
Isotipo: IgG1 de ratón, κ
Inmunógeno: PARP humana escindida
Aplicación: Tinción intracelular (citometría de flujo) (probada rutinariamente), bioimagen, inmunofluorescencia (probada durante el desarrollo)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_1645431
Tampón de almacenamiento: solución tamponada acuosa que contiene BSA, estabilizador de proteínas y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con Alexa Fluor® 647 en condiciones óptimas y se eliminó el Alexa Fluor® 647 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados para bioimagen • La estaurosporina (de Streptomyces staurosporeus) es un inhibidor de la proteína quinasa relativamente no selectivo que se utiliza a menudo como agente general para inducir la apoptosis. Se debe preparar una solución madre de estaurosporina 2 μM en el medio de cultivo antes de su uso. • Este anticuerpo tiñe células HeLa (ATCC CCL-2), A549 (ATCC CCL-185) y U-2 OS (ATCC HTB-96), y funciona con metanol frío al 90 % o con tampón de permeabilización BD Perm/Wash™. 1. Siembre las células en un medio de cultivo adecuado a unas 10 000 células por pocillo en una placa de imágenes BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353219) y cultive durante la noche. 2. Añada las concentraciones adecuadas de estaurosporina, diluida en 100 μl de medio de cultivo, a los pocillos y cultive durante 4 horas. 3. Fije las células añadiendo 100 µl de una solución de formaldehído al 12 % precalentada (37 °C) a cada pocillo e incubándolas durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA). El volumen final es de 300 μl por pocillo con una concentración final de formaldehído del 4 %. 4. Retire el fijador de los pocillos y lave las células dos veces con PBS 1×. 5. Permeabilice las células utilizando metanol frío al 90 % a -20 °C (p. ej., BD Phosflow™ Perm Buffer III, n.º de cat. 558050) o el tampón BD Perm/Wash™ (n.º de cat. 554723): a. Añadir 100 µl de metanol al 90 % a -20 °C, tampón de permeación BD Phosflow™ III (n.º de cat. 558050), a cada pocillo e incubar durante 5 minutos. o b. Añadir 100 µl de tampón BD Perm/Wash™ 1× a cada pocillo e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. 6. Retirar el permeabilizador y lavar los pocillos dos veces con 100 µl de PBS 1×. 7. Diluir el conjugado de anticuerpo anti-PARP escindida (Asp 214) de ratón Alexa Fluor® 647: a. Si las células se permeabilizaron con metanol frío, diluir el anticuerpo 1:10 en PBS 1× o b. Si las células se permeabilizaron con el tampón BD Perm/Wash™, diluya el anticuerpo 1:10 en tampón BD Perm/Wash™ 1×. 8. Tiña las células añadiendo 50 µl del conjugado de anticuerpo diluido a cada pocillo e incubándolo durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C, protegido de la luz. 9. Retire el conjugado de anticuerpo diluido y lave los pocillos dos veces con 100 µl de PBS 1X. Retire el PBS. 10. Para contrateñir los núcleos, diluya la solución Hoechst 33342 (n.º de cat. 561908) a 2 µg/ml en PBS 1× y añada 200 µl a cada pocillo al menos 15 minutos antes de la adquisición de imágenes. 11. Observe y analice las células en un instrumento de adquisición de imágenes adecuado. Los filtros recomendados para los instrumentos BD Pathway™ son: Instrumento Excitación Emisión Dicroico BD Pathway 855 620/60 700/75 660 LP BD Pathway 435 628/40 690/40 FF660 Para citometría de flujo • Se ha informado que la camptotecina, un extracto del árbol chino Camptotheca acuminata, induce la apoptosis de manera dependiente de la dosis in vitro. Se debe preparar una solución madre de camptotecina 1,0 mM (p. ej., Sigma-Aldrich; n.º de cat. C-9911) en DMSO antes de usar. 1. Agregue camptotecina a una concentración final de 4-6 µM por 1 x 10^6 células Jurkat en proliferación (leucemia de células T humanas; ATCC TIB-152). También se debe preparar una alícuota de control de células sin tratar. Incubar las células durante 4 a 18 horas en una incubadora a 37 °C. 2. Lavar las células dos veces con PBS frío, resuspenderlas en solución BD Cytofix/Cytoperm™ a 2 x 10^6 células/ml e incubar durante 20 minutos en hielo. 3. Sedimentar las células, aspirar y desechar la solución BD Cytofix/Cytoperm™. 4. Lavar las células dos veces a temperatura ambiente con 0,5 ml de tampón BD Perm/Wash™ por 1 x 10^6 células y desechar los sobrenadantes. 5. Resuspender las células en tampón BD Perm/Wash™ a 10 x 10^6 células/ml y alícuotas de muestras de prueba de 1 x 10^6 células por cada 100 µl de prueba. 6. Añada 5 µl de anticuerpo anti-PARP escindido de ratón Alexa Fluor® 647 (Asp 214) por prueba e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. 7. Lave cada prueba en 1,0 ml de tampón BD Perm/Wash™ y deseche el sobrenadante. 8. Resuspenda cada prueba en 0,5 ml de tampón BD Perm/Wash™ y analice mediante citometría de flujo.
Avisos del producto: Avisos del producto Este anticuerpo ha sido desarrollado y certificado para la aplicación de bioimagen. Sin embargo, no se realiza una prueba de bioimagen de rutina en cada lote. Se recomienda a los investigadores titular el reactivo para un rendimiento óptimo. Este reactivo ha sido prediluido para su uso en el volumen recomendado por prueba. Normalmente usamos 1 × 10^6 células en una muestra experimental de 100 µl (una prueba). La emisión del fluorocromo Alexa Fluor® 647 se recoge en la misma configuración del instrumento que para la aloficocianina (APC). Para los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Los conjugados de anticuerpos colorantes Alexa Fluor®, Pacific Blue™ y Cascade Blue® en este producto se venden bajo licencia de Molecular Probes, Inc. solo para uso en investigación, excluyendo el uso en combinación con microarrays o como reactivos específicos de analito. Los colorantes Alexa Fluor® (excepto Alexa Fluor® 430), Pacific Blue™ y Cascade Blue® están protegidos por patentes en trámite y emitidas. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Alexa Fluor® es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.