BD, 559934, BD Pharmingen™ Cy™5 Anexina V

Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_2869267
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Cy™5 Annexin V es una sonda sensible para identificar células apoptóticas, que se une a superficies de fosfolípidos con carga negativa (Kd de ~5 x 10e2) con una mayor afinidad por la fosfatidilserina (PS) que la mayoría de los demás fosfolípidos. La unión de Cy™5 Annexin V depende del calcio y se requieren concentraciones definidas de calcio y sal para una tinción óptima, como se describe en el Protocolo de tinción de Cy™5 Annexin V. Los investigadores deben tener en cuenta que el análisis de citometría de flujo de Cy™5 Annexin V en tipos de células adherentes (p. ej., HeLa, NIH 3T3, etc.) no se prueba de forma rutinaria, ya que puede producirse un daño específico de la membrana durante el desprendimiento o la recolección de células. Sin embargo, se han informado previamente métodos para utilizar Annexin V para citometría de flujo en tipos de células adherentes (Casiola-Rosen et al. y van Engelend et al.). INDUCCIÓN DE APOPTOSIS POR CAMPTOTECINA El siguiente protocolo se proporciona como una ilustración de cómo se puede usar Cy™5 Annexin V en una línea celular (Jurkat). Materiales 1. Prepare la solución madre de camptotecina (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 mM en DMSO. 2. Células T Jurkat (ATCC TIB-152). Procedimiento 1. Añada camptotecina (concentración final 4-6 µM) a 1 x 10e6 células Jurkat. 2. Incube las células durante 4-6 horas a 37 °C. 3. Proceda con el protocolo de tinción de Cy™5 Annexin V para medir la apoptosis. PROTOCOLO DE TINCIÓN DE Cy™5 ANEXIN V Reactivos 1. Cy™5 Annexin V: Incluido. Use 5 µl por prueba. 2. 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD): No incluido. El 7-AAD (n.º de cat. 559925) es un colorante de ácido nucleico práctico y listo para usar, con fluorescencia detectable en el rango rojo lejano del espectro. Use 5 µl por prueba. 3. Tampón de unión 10X: No incluido. Hepes 0,1 M (pH 7,4), NaCl 1,4 M, CaCl₂ 25 mM. Conservar a 4 °C. Como alternativa, puede adquirirse el tampón de unión de anexina V, concentrado 10X (n.º de cat. 556454). Tinción: 1. Lave las células dos veces con PBS frío y, a continuación, resuspéndalas en tampón de unión 1X a una concentración de 1 x 10⁻¹ células/ml. 2. Transfiera 100 µl de la solución (1 x 10⁻¹ células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Añada 5 µl de Cy™5 Annexin V (para análisis de uno y dos colores) y 5 µl de 7-AAD (solo para análisis de dos colores). 4. Agite suavemente las células e incube durante 15 min a temperatura ambiente (25 °C) en oscuridad. 5. Añada 400 µl de tampón de unión 1X a cada tubo. Analice mediante citometría de flujo en 1 h. CONTROLES SUGERIDOS PARA LA CONFIGURACIÓN DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO: La longitud de onda de emisión de Cy™5 es de 670 nm y la de excitación, de 625-650 nm. Cy5 está optimizado para la fluorescencia FL4 en el citómetro de flujo BD FACSCalibur™. Para el citómetro de flujo BD FACSVantage™, el filtro de emisión recomendado es 675/20. Los siguientes controles se utilizan para configurar la compensación y los cuadrantes: 1. Células sin teñir. 2. Células teñidas solo con Cy™5 Anexina V (sin 7-AAD). 3. Células teñidas solo con 7-AAD (sin Cy™5 Anexina V). Otros controles de tinción Se debe utilizar una línea celular que pueda inducirse fácilmente a apoptosis para obtener una tinción de control positiva con Cy™5 Anexina V y/o Cy™5 Anexina V y 7-AAD. Es importante destacar que el nivel basal de apoptosis y necrosis varía considerablemente dentro de una población. Por lo tanto, incluso en ausencia de apoptosis inducida, la mayoría de las poblaciones celulares contendrán un pequeño porcentaje de células que son positivas para apoptosis (positivas para Cy™5 Anexina V, negativas para 7-AAD o positivas para Cy™5 Anexina V, positivas para 7-AAD). La población sin tratar se utiliza para definir el nivel basal de células apoptóticas y muertas. El porcentaje de células inducidas a apoptosis se determina restando el porcentaje de células apoptóticas en la población no tratada del porcentaje de células apoptóticas en la población tratada. Dado que la muerte celular es el resultado final de la apoptosis celular, las células en las últimas etapas de la apoptosis tendrán una membrana dañada y se tiñerán positivamente para 7-AAD, así como para Cy™5 Anexina V. Por lo tanto, el ensayo no distingue entre células que ya han sufrido muerte celular apoptótica y aquellas que han muerto como resultado de la vía necrótica, ya que en ambos casos las células muertas se tiñerán tanto con Cy™5 Anexina V como con 7-AAD.
Avisos del producto: Debido a que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Cy es una marca registrada de GE Healthcare. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.