BD, 560506, BD Horizon™ V450 Anexina V

Isotipo: nulo nulo
Aplicación: Citometría de flujo (probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_2869356
Tampón de almacenamiento: solución tamponada acuosa que contiene BSA, estabilizador de proteínas y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con BD Horizon™ V450 en condiciones óptimas y se eliminó el BD Horizon™ V450 que no reaccionó.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados V450 Annexin V es una sonda sensible para identificar células apoptóticas, que se une a superficies de fosfolípidos con carga negativa (Kd de ~5 x 10^-2) con una mayor afinidad por la fosfatidilserina (PS) que la mayoría de los demás fosfolípidos. La unión de V450 Annexin V depende del calcio y se requieren concentraciones definidas de calcio y sal para una tinción óptima, como se describe en el Protocolo de tinción de V450 Annexin V. Los investigadores deben tener en cuenta que el análisis de citometría de flujo de V450 Annexin V en tipos de células adherentes (p. ej., HeLa, NIH 3T3, etc.) no se prueba de forma rutinaria, ya que puede producirse un daño específico de la membrana durante el desprendimiento o la recolección de células. Sin embargo, se han informado previamente métodos para utilizar Annexin V para citometría de flujo en tipos de células adherentes (Casiola-Rosen et al. y van Engelend et al.). INDUCCIÓN DE APOPTOSIS POR CAMPTOTECINA El siguiente protocolo se proporciona como una ilustración de cómo se puede utilizar la anexina V V450 en una línea celular (Jurkat). Materiales 1. Prepare la solución madre de camptotecina (Sigma-Aldrich Cat. No. C-9911): 1 mM en DMSO. 2. Células T Jurkat (ATCC TIB-152). Procedimiento 1. Añada camptotecina (concentración final 4-6 µM) a 1 x 10^6 células Jurkat. 2. Incube las células durante 4-6 horas a 37 °C. 3. Proceda con el protocolo de tinción de anexina V V450 para medir la apoptosis. PROTOCOLO DE TINCIÓN DE ANEXINA V V450 La anexina V V450 se utiliza para determinar cuantitativamente el porcentaje de células dentro de una población que están experimentando apoptosis activamente. Depende de la propiedad de las células de perder la asimetría de la membrana en las fases tempranas de la apoptosis. La anexina V es una proteína de unión a fosfolípidos dependiente del calcio que tiene una alta afinidad por la PS y es útil para identificar células apoptóticas con PS expuesta. El yoduro de propidio (PI) es una sonda de viabilidad citométrica de flujo estándar y se utiliza para distinguir las células viables de las no viables. Reactivos 1. V450 Anexina V: Incluido. Use 5 µl por prueba. 2. Yoduro de propidio (PI): No incluido. PI (Cat.No. 556463) es un colorante de ácido nucleico conveniente y listo para usar. Use hasta 10 µl por prueba de una solución de 50 µg/ml. 3. Tampón de unión 10×: No incluido. Hepes 0,1 M (pH 7,4), NaCl 1,4 M, CaCl2 25 mM. Almacenar a 4 °C. Como alternativa, puede adquirir el concentrado 10X de tampón de unión de anexina V BD Pharmingen™ (n.º de cat. 556454). Tinción 1. Lave las células dos veces con PBS frío y, a continuación, resuspéndalas en tampón de unión 1× a una concentración de 1 × 10^6 células/ml. 2. Transfiera 100 µl de la solución (1 × 10^5 células) a un tubo de cultivo de 5 ml. 3. Añada 5 µl de anexina V V450. 4. Añada 10 µl de PI. La concentración óptima de PI puede variar entre líneas celulares, donde 10 µl de una solución madre de 50 µg/ml es probablemente el máximo necesario. Una concentración menor puede dar resultados óptimos en algunos sistemas experimentales. 5. Agite suavemente las células con vórtex e incube durante 15 min a temperatura ambiente (25 °C) en oscuridad. 6. Añada 400 µl de tampón de unión 1× a cada tubo. Analice mediante citometría de flujo en 1 hora. CONTROLES SUGERIDOS PARA CONFIGURAR LA CITOMETRÍA DE FLUJO Los siguientes controles se utilizan para configurar la compensación y los cuadrantes: 1. Células sin teñir. 2. Células teñidas con V450 Annexin V (sin IP). 3. Células teñidas con IP (sin V450 Annexin V). Otros controles de tinción: Se debe utilizar una línea celular que pueda inducirse fácilmente a sufrir apoptosis para obtener una tinción de control positiva con V450 Annexin V y/o V450 Annexin V y IP. Es importante tener en cuenta que el nivel basal de apoptosis y necrosis varía considerablemente dentro de una población. Por lo tanto, incluso en ausencia de apoptosis inducida, la mayoría de las poblaciones celulares contendrán un pequeño porcentaje de células que sean positivas para la apoptosis (V450 Annexin V positivas, IP negativas o V450 Annexin V positivas, IP positivo). La población no tratada se utiliza para definir el nivel basal de células apoptóticas y muertas. El porcentaje de células inducidas a la apoptosis se determina restando el porcentaje de células apoptóticas de la población no tratada del porcentaje de células apoptóticas de la población tratada. Dado que la muerte celular es el resultado final de la apoptosis celular, las células en las últimas etapas de la apoptosis tendrán una membrana dañada y se tiñerán positivamente tanto para PI como para V450 Anexina V. Por lo tanto, el ensayo no distingue entre células que ya han sufrido muerte celular apoptótica y aquellas que han muerto como resultado de la vía necrótica, ya que en ambos casos las células muertas se tiñerán tanto con V450 Anexina V como con PI.
Avisos del producto: Avisos del producto Este reactivo ha sido prediluido para su uso al volumen recomendado por prueba. Normalmente usamos 1 × 10^6 células en una muestra experimental de 100 µl (una prueba). La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. BD Horizon V450 tiene una absorción máxima de 406 nm y una emisión máxima de 450 nm. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo es capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Pacific Blue™ es una marca registrada de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Para conocer los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos.