BD, 565455, Kit de proliferación BD Pharmingen™ 488 EdU Click

Aplicación: Inmunocitoquímica, Inmunofluorescencia, Tinción intracelular (citometría de flujo) (Probado durante el desarrollo)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869677
Descripción: El kit de proliferación BD Pharmingen™ 488 EdU Click proporciona una herramienta para analizar la síntesis de ADN en células en ciclo. En este método, el análogo de timidina EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) se incorpora al ADN recién sintetizado por las células que progresan a través de la fase S (síntesis de ADN) del ciclo celular. EdU puede detectarse posteriormente en células fijadas y permeabilizadas con una azida marcada con fluoróforo. La reacción entre la azida marcada con fluoróforo y EdU se produce mediante una reacción de clic catalizada por cobre entre la fracción azida del fluoróforo y la fracción alquina de EdU. Al coteñirse con un colorante de ADN como 7-AAD, PI o DAPI, las poblaciones celulares pueden segmentarse mediante citometría de flujo en las fases G0/G1 (contenido de ADN 2N, EdU negativo), fase S (contenido de ADN 2N-4N, EdU positivo) o fases G2/M (contenido de ADN 4N, EdU negativo). El kit de proliferación BD Pharmingen™ 488 EdU Click contiene 6-FAM azida, excitada por el láser azul, con una excitación máxima de 496 nm y una emisión máxima de 516 nm. Tenga en cuenta que este kit se suministra como la Parte 1 de 2 (Componentes A, B y C) que debe almacenarse en un lugar seco y protegido de la luz a -20 °C, y la Parte 2 de 2 (Componentes D, E, F y G) que debe almacenarse en un lugar seco a 2-8 °C o a temperatura ambiente. Contenido del kit ID del componente Descripción del componente Cantidad Condiciones de almacenamiento a largo plazo A EdU (5-etinil-2´-desoxiuridina) 10 mg -20 °C, seco B Azida 6-FAM (10 mM) 130 μL -20 °C, seco, oscuro C Aditivo tampón (10×) 400 mg -20 °C, seco D Reactivo de permeabilización y lavado a base de saponina (10×) 50 mL 2 - 8 °CE Solución fijadora (a base de paraformaldehído al 4 %) 5 mL 2 - 8 °CF Solución catalizadora 2 mL RT, seco G DMSO 5 mL RT, seco Tenga en cuenta que las advertencias de peligro para los componentes enumerados anteriormente se encuentran en la página 5 de este documento.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados A. Materiales necesarios pero no suministrados • Células de interés • Tubos FACS o placas/portaobjetos de imágenes • Solución salina tamponada, como PBS, DPBS o TBS • Tampón de tinción BD Pharmingen™ (BSA) (n.º de cat. 554657) o tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656) • Agua desionizada • Anticuerpos o colorantes fluorescentes para análisis inmunofenotípico o funcional (opcional) • Colorante de contenido de ADN (opcional) B. Requisitos de citometría Se pueden utilizar citómetros equipados con láser azul (BD FACSCanto™ II, BD LSRFortessa™, BD LSR™ II y citómetro de flujo BD Accuri™ C6). El 6-FAM se puede leer en filtros comúnmente usados ​​para FITC o Alexa Fluor® 488 (p. ej., filtro de paso de banda 530/30). La compensación de fluorescencia se logra mejor usando una muestra de las células de interés. La incorporación de EdU se analiza mejor con amplificación logarítmica, mientras que el contenido total de ADN se analiza mejor con amplificación lineal. Si se va a evaluar el contenido de ADN, las muestras deben adquirirse a una velocidad de flujo baja para generar la mejor resolución de las poblaciones 2N y 4N. C. Preparación de las soluciones madre 1. Deje que todos los viales alcancen la temperatura ambiente antes de abrirlos. 2. Componente A: Para la preparación de una solución madre de EdU 10 mM, agregue 4 mL de DMSO o PBS 1× a EdU y mezcle hasta que se disuelva por completo. Después de usar, guarde la solución restante a -20 °C. Cuando se almacena según las instrucciones, esta solución madre es estable hasta por un año. Recomendamos preparar alícuotas para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. 3. Componente B: Para la azida 6-FAM, recomendamos preparar alícuotas para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Las alícuotas deben almacenarse en un lugar seco y protegido de la luz a -20 °C. 4. Componente C: Para la preparación de una solución madre 10× del aditivo tampón, añada 4 ml de agua desionizada al aditivo tampón y mezcle hasta su completa disolución. Después de su uso, guarde la solución restante a -20 °C. Si se almacena según las instrucciones, esta solución madre es estable hasta 6 meses. Si la solución comienza a adquirir un color marrón, se ha degradado y debe desecharse. Recomendamos preparar alícuotas para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. 5. Componente D: Para la preparación de 500 ml de tampón de permeabilización a base de saponina 1× y reactivo de lavado, añada 50 ml del Componente D a 450 ml de BSA al 1 % en PBS 1×. Después de usar, guarde la solución restante a 2-8 °C. Procedimiento de tinción recomendado: citometría de flujo. Marcaje de células con EdU 1. Añada la cantidad deseada de EdU a las células en el medio de cultivo. Hemos descubierto que una concentración final de 10 μM de EdU es suficiente para marcar líneas celulares humanas y de ratón, y poblaciones de células primarias. a. Durante la adición de EdU a las células en cultivo, evite alterar las células de cualquier forma (p. ej., pasos de centrifugación o cambios de temperatura) que puedan alterar los patrones normales de ciclado celular. La densidad del cultivo celular no debe superar las 2 × 10^6 células/ml. 2. Incube las células tratadas durante el tiempo deseado. Los distintos tipos de células pueden requerir distintos periodos de incubación para un marcaje óptimo con EdU. Como punto de partida, recomendamos 10 μM de EdU durante 1 hora. 3. Coseche las células, sedimente por centrifugación y retire el medio que contiene EdU. 4. Desaloje el sedimento celular, resuspenda las células en tampón de tinción BD Pharmingen™ (BSA) (n.º de cat. 554657) o tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656) a 1 × 10^7 células/ml y divida en alícuotas 1 × 10^6 células por tubo FACS de 12 × 75 mm. 5. Si no desea teñir para antígenos de superficie, añada 1 ml de tampón de tinción BD Pharmingen™, sedimente las células por centrifugación, retire el sobrenadante y continúe con el paso D9. Tinción de antígenos de superficie celular (opcional) 6. Añada anticuerpos fluorescentes específicos para marcadores de superficie celular a los tubos y agite suavemente para mezclar. a. Debido a que el cóctel de reacción de clic contiene cobre y se sabe que el cobre extingue la fluorescencia de R-PE, los conjugados de anticuerpos que contienen R-PE o tándems de R-PE deben teñirse después de la reacción de clic (tinción de antígenos intracelulares y/o de superficie, pasos D19-22). 7. Incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente o en hielo. 8. Lavar las muestras añadiendo 1 mL de tampón de tinción BD Pharmingen™, sedimentando por centrifugación y eliminando el sobrenadante. Fijación y permeabilización de las células 9. Desalojar el sedimento celular y resuspender las células en 100 μL de solución fijadora (componente E) por tubo. 10. Incubar las células durante 15 minutos a temperatura ambiente. 11. Lavar las muestras añadiendo 1 mL de tampón de tinción BD Pharmingen™, sedimentando por centrifugación y eliminando el sobrenadante. 12. Desaloje el pellet celular, resuspenda las células en 100 μL de tampón de permeabilización a base de saponina 1× (preparado en el paso C5) y agite suavemente para mezclar. Detección de la incorporación de EdU 13. Prepare la mezcla de ensayo como se describe en la Tabla I después de la sección G, agregando reactivos en el mismo orden indicado en la tabla. Si los ingredientes no se agregan en el orden indicado, la reacción puede no proceder óptimamente o puede fallar. Una vez preparada la mezcla de ensayo, úsela dentro de los siguientes 15 minutos. a. Tenga en cuenta que en algunos casos, la titulación de la azida del colorante (Componente B) puede aumentar la resolución de las poblaciones positivas y negativas de EdU. En este caso, diluya una alícuota del Componente B con una cantidad apropiada de DMSO y agregue 1 μL de la azida del colorante diluida en lugar del stock concentrado. 14. Agregue 500 μL de la mezcla de ensayo a cada muestra y agite suavemente para mezclar. 15. Incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente protegidas de la luz. 16. Lavar las muestras añadiendo 2 mL de tampón de permeabilización a base de saponina 1× (preparado en el paso C5), sedimentar por centrifugación y retirar el sobrenadante. 17. Repetir el paso D16. 18. Si no se desea teñir los antígenos intracelulares o el contenido de ADN, desalojar el sedimento celular y resuspender las células en 500 μL de PBS 1× o equivalente, y proceder al análisis en el citómetro de flujo. Tinción de antígenos intracelulares y/o de superficie (opcional) 19. Desalojar el sedimento celular y resuspender las células en 100 μL de tampón de tinción BD Pharmingen™. 20. Añadir anticuerpos fluorescentes específicos para marcadores intracelulares y/o de superficie a los tubos y agitar suavemente en vórtex para mezclar. a. Debido a que el cóctel de reacción de clic contiene cobre y se sabe que el cobre apaga la fluorescencia de R-PE, los conjugados de anticuerpos que contienen R-PE o tándems de R-PE deben teñirse en este punto del procedimiento. 21. Incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente o en hielo. 22. Lavar las muestras añadiendo 1 mL de tampón de tinción BD Pharmingen™, sedimentar por centrifugación y retirar el sobrenadante. Tinción para contenido total de ADN (opcional) 23. Desalojar el sedimento celular y resuspender en 500 μL de PBS 1× que contenga una cantidad apropiada de colorante de ADN (p. ej., DAPI, PI o 7-AAD) para el tipo de célula de interés. Mezclar suavemente con vórtex. 24. Proceder al análisis por citometría de flujo. E. Procedimiento de tinción recomendado: bioimágenes Este ensayo se optimizó para la obtención de imágenes en placas de 96 pocillos. Es posible que sea necesario optimizar los volúmenes de reactivos para otras geometrías de obtención de imágenes. Marcaje de células con EdU 1. Cultive el tipo celular deseado en pocillos. 2. Añada la cantidad deseada de EdU a las células en el medio de cultivo o sustitúyalo por medio fresco precalentado que contenga la cantidad deseada. Se ha comprobado que una concentración final de 10 μM de EdU es suficiente para el marcaje de líneas celulares humanas y murinas, así como de poblaciones celulares primarias. a. Durante la adición de EdU a las células en cultivo, evite cualquier alteración celular (p. ej., centrifugación o cambios de temperatura) que pueda alterar los patrones normales de ciclado celular. La densidad del cultivo celular no debe superar el 70 % de confluencia. 3. Incube las células tratadas durante el tiempo deseado. Los diferentes tipos de células pueden requerir diferentes periodos de incubación para un marcaje óptimo con EdU. 4. Retire el medio que contiene EdU, lave las células una vez en BD Pharmingen™ Stain Buffer (BSA) (N.º de cat. 554657) o BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (N.º de cat. 554656) y retire el tampón de lavado. Si no desea teñir los antígenos de superficie, continúe con el paso E8. Tinción de antígenos de superficie celular (opcional) 5. Prepare anticuerpos fluorescentes específicos para marcadores de superficie celular en BD Pharmingen™ Stain Buffer y añádalos a las muestras. El volumen de tinción debe ser lo suficientemente grande como para cubrir el pocillo por completo (p. ej., al menos 50 μL para 96 ​​pocillos). 6. Incube las muestras durante 60 minutos a temperatura ambiente. 7. Lave las muestras dos veces con BD Pharmingen™ Stain Buffer y retire el tampón de lavado. Fijación y permeabilización de las células 8. Añada la solución fijadora (componente E) a cada muestra. El volumen de la solución fijadora debe ser lo suficientemente grande como para cubrir el pocillo por completo (p. ej., al menos 50 μL para 96 ​​pocillos). 9. Incubar las muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente. 10. Lavar las muestras dos veces con el tampón de tinción BD Pharmingen™ y retirar el tampón de lavado. 11. Añadir 1× tampón de permeabilización a base de saponina (preparado en el paso C5) a cada muestra. El volumen del tampón de permeabilización debe ser lo suficientemente grande como para cubrir el pocillo por completo (p. ej., al menos 50 μL para 96 ​​pocillos). 12. Incubar las muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente. Detección de la incorporación de EdU 13. Preparar una solución de trabajo del colorante azida (Componente B) diluyendo 1:5 con DMSO (p. ej., diluir 1 μL de colorante azida con 4 μL de DMSO). Mezclar bien con vórtex. 14. Prepare la mezcla de ensayo como se describe en la Tabla II, después de la sección G, añadiendo los reactivos en el mismo orden indicado en la tabla. Si los ingredientes no se añaden en el orden indicado, la reacción podría no proceder de forma óptima o fallar. Una vez preparada la mezcla de ensayo, úsela en los siguientes 15 minutos. a. Tenga en cuenta que, en algunos casos, la titulación de la azida colorante (Componente B) puede aumentar la resolución de las poblaciones positivas y negativas de EdU. En este caso, diluya la solución de trabajo de azida colorante preparada en el paso E13 con una cantidad adecuada de DMSO y añada 1 μL de la solución de trabajo diluida en lugar de la solución de trabajo concentrada. 15. Añada 100 μL de la mezcla de ensayo a cada muestra, además de los 50 μL de tampón de permeabilización a base de saponina 1× añadido en el paso E11. Si es necesario, se puede usar más cóctel por muestra, pero todos los componentes deben mantenerse en las mismas proporciones y agregarse en el mismo orden para que la reacción se realice de manera óptima. 16. Incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegidas de la luz. 17. Lavar las muestras dos veces con tampón de permeabilización a base de saponina 1X (preparado en el paso C5), 5 minutos por lavado, y eliminar el tampón de lavado. 18. Si no desea teñir los antígenos intracelulares o el contenido de ADN, agregar PBS a cada muestra y proceder a la obtención de imágenes. El volumen de PBS debe ser suficiente para cubrir completamente los pocillos (p. ej., al menos 50 μL para 96 ​​pocillos). Tinción de antígenos intracelulares y/o de superficie (opcional) 19. Preparar anticuerpos fluorescentes específicos para marcadores intracelulares y/o de superficie en tampón de tinción BD Pharmingen™ y agregar a las muestras. El volumen de tinción debe ser lo suficientemente grande como para cubrir el pocillo por completo (p. ej., al menos 50 μL para 96 ​​pocillos). 20. Incubar las muestras durante 60 minutos a temperatura ambiente. 21. Lavar las muestras dos veces con BD Pharmingen™ Stain Buffer y retirar el tampón de lavado. Tinción para contenido total de ADN (opcional) 22. Añadir 100 μL de PBS 1× que contenga una cantidad apropiada de colorante de ADN (p. ej., DAPI o 7-AAD) para el tipo de célula de interés. 23. Proceder al análisis por bioimagen. F. Notas 1. El cóctel de reacción clic contiene cobre, que se sabe que apaga la fluorescencia de R-PE. Los conjugados de anticuerpos que contienen PE o R-PE deben teñirse después de la reacción clic. 2. El cobre presente en el cóctel de reacción clic puede afectar la unión de los anticuerpos anti-GFP a sus epítopos. Recomendamos teñir con anticuerpos anti-GFP antes de la reacción clic. 3. Se ha descubierto que los colorantes orgánicos (p. ej., colorantes Alexa Fluor®), PerCP-Cy™5.5, APC, Brilliant™ Violet y Brilliant™ Ultraviolet son compatibles con la reacción de clic. 4. Pueden producirse grandes cambios en la autofluorescencia por la exposición al cóctel de componentes de clic. Recomendamos que todos los controles, incluidos los controles sin teñir y los de una sola tinción, también se traten con el cóctel de componentes de clic con o sin el colorante azida, según corresponda, de modo que las muestras de control y de prueba muestren las mismas propiedades de autofluorescencia. G. Identificación de peligros Advertencia: El componente B, 6-FAM azida (10 mM), número de material 51-9012109, contiene 99,6 % de DMSO. Indicaciones de peligro Líquido combustible. Declaraciones de precaución Mantener alejado de llamas y superficies calientes. - No fumar. Usar guantes/protección ocular. Usar ropa protectora. En caso de incendio: Utilizar para la extinción: CO2, polvo o agua pulverizada. Almacenar en un lugar bien ventilado. Mantener en un lugar fresco. Peligro: Componente E, Solución fijadora, Número de material 51-9012105, contiene 4% de formaldehído. Indicaciones de peligro Nocivo si se inhala. Provoca irritación cutánea. Provoca lesiones oculares graves. Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Se sospecha que provoca defectos genéticos. Puede provocar cáncer. Vía de exposición: Inhalación. Puede causar irritación respiratoria. Consejos de precaución No respirar la niebla/los vapores/el aerosol. Llevar ropa de protección/protección ocular. Llevar guantes de protección. En caso de contacto con los ojos: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando. En caso de irritación o erupción cutánea: Consultar a un médico. Eliminar el contenido/el recipiente de conformidad con la normativa local/regional/nacional/internacional. Componente F, Solución catalizadora, Número de material 51-9012106, contiene 1,6% de sulfato de cobre. Indicaciones de peligro Nocivo para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos. · Consejos de precaución Evitar su liberación al medio ambiente. Deseche el contenido/recipiente de acuerdo con la normativa local, regional, nacional e internacional. Advertencia: El componente G, número de material 51-9012107, contiene DMSO. Indicaciones de peligro: Líquido combustible. Consejos de precaución: Mantener alejado de llamas y superficies calientes. - No fumar. Usar guantes/protección ocular. Usar ropa protectora. En caso de incendio: Utilizar para la extinción: CO₂, polvo o agua pulverizada. Almacenar en un lugar bien ventilado. Mantener fresco. Mostrar menos
Avisos del producto: Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Licencia de etiqueta de uso limitado — Solo para investigación: La compra de este producto otorga al comprador el derecho limitado e intransferible de usar la cantidad adquirida únicamente para realizar investigaciones, y no para ningún uso clínico, diagnóstico, vacunal, protector, profiláctico, preventivo o terapéutico en humanos, animales o plantas. Alexa Fluor™ es una marca registrada de Life Technologies Corporation. Mostrar menos