BD, 565877, BD Pharmingen™ Hoechst 34580

Reactividad: Humano, Ratón (Probado en desarrollo)
Aplicación: Citometría de flujo, Inmunocitoquímica, Inmunofluorescencia, Tinción intracelular (citometría de flujo) (Probado durante el desarrollo)
ID de registro: AB_2869723
Tampón de almacenamiento: polvo liofilizado
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento Conservar a -20°C, protegido de la exposición a la luz.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Preparación Lleve BD Pharmingen™ Hoechst 34580 y 1 mL de agua destilada a temperatura ambiente. Añada 1 mL de agua destilada al vial de colorante y mezcle bien para obtener una solución de 1 mg/mL. Inspeccione la solución y repita la mezcla hasta que el colorante madre se haya disuelto completamente. Almacenamiento A su llegada, almacene el colorante seco desecado y protegido de la luz a ≤ -20 °C hasta su uso. Después de la reconstitución con agua, almacene el colorante reconstituido a ≤ -20 °C en pequeñas alícuotas. El colorante reconstituido es estable durante al menos 6 meses si se almacena según las instrucciones. Procedimiento Tinción inmunofluorescente de células vivas para visualización nuclear 1. Diluya la solución de Hoechst 34580 a 1-5 μg/mL en medio completo inmediatamente antes de usar. 2. Añada la solución Hoechst 34580 a cada muestra e incube a 37 °C durante 30-60 minutos. El tiempo de tinción necesario depende del tipo celular. 3. Aspire el medio con Hoechst 34580 y añada tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656) o PBS 1×. Las células también pueden analizarse sin lavar, pero esto puede aumentar el fondo del colorante no unido. 4. Proceda al análisis de inmunofluorescencia. 5. Tinción inmunofluorescente de células fijadas para visualización nuclear. 1. Fije y permeabilice las células según se desee. 2. Diluya la solución Hoechst 34580 a 0,5-2 µg/ml en PBS 1× inmediatamente antes de su uso. 3. Añada la solución Hoechst 34580 a cada muestra al menos 15 minutos antes del análisis. 4. Proceder al análisis de inmunofluorescencia sin lavar.. 5. Tinción de células vivas para análisis de contenido de ADN por citometría de flujo 1. Obtener una suspensión de células individuales. 2. Resuspender las células a 1 × 10^6 células/mL en medio completo que contenga 1-10 μg/mL de Hoechst 34580. Alternativamente, Hoechst 34580 se puede agregar directamente al cultivo sin sedimentar si la densidad celular del cultivo no excede 1 × 10^6 células/mL. a. Si se tiñe a 1 × 10^7 células/mL (por ejemplo, 1 × 10^6 células en 100 μL), la concentración de tinción recomendada es 5-10 μg/mL de Hoechst 34580. 3. Incubar a 37 °C durante 15-60 minutos. a. La densidad celular óptima, la concentración de Hoechst 34580 y el tiempo de tinción para el análisis del contenido de ADN pueden variar según el tipo de célula. Las condiciones del ensayo deben optimizarse en experimentos preliminares para obtener mejores resultados. 4. Sedimente las células mediante centrifugación y aspire el medio que contiene Hoechst 34580. a. Si se va a realizar un análisis de ARN (p. ej., RNA-seq) después de completar el análisis del contenido de ADN, lave las células 2-3 veces en un tampón sin suero (p. ej., 1× PBS) para asegurar la eliminación completa de la ARNasa residual presente en el medio de cultivo celular. 5. Resuspenda las células en BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) o 1× PBS y proceda al análisis por citometría de flujo. a. Si se van a clasificar las células, agregar Hoechst 34580 de nuevo al tampón de análisis durante la adquisición a la concentración de tinción utilizada puede prevenir la extrusión del colorante durante la clasificación. b. Las muestras deben procesarse a una velocidad de flujo baja para lograr los mejores resultados. El aumento de las tasas de flujo puede dar como resultado un % CV más alto para cada compartimento del ciclo celular en el histograma de ADN. c. Los paquetes de software como ModFit LT™ (Verity Software House) o FlowJo™ (FlowJo, LLC) pueden ser útiles para deconvolucionar los histogramas de contenido de ADN en compartimentos del ciclo celular. 6. Tinción de células fijas para análisis de contenido de ADN por citometría de flujo 1. Obtenga una suspensión de células individuales. 2. Trate las células en hielo durante 30 minutos con etanol helado al 70-80%. 3. Lave las células una vez con BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS). 4. Diluya la solución Hoechst 34580 a 0,2-2 μg/mL en BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) o 1× PBS inmediatamente antes de usar. 5. Teñir las células durante 15 minutos a temperatura ambiente a una densidad celular de 1-2 × 10^6 células/mL. No es necesario lavar antes del análisis. a. La densidad celular y la concentración óptimas de Hoechst 34580 para el análisis del contenido de ADN pueden variar según el tipo celular. Las condiciones del ensayo deben optimizarse en los primeros experimentos para obtener los mejores resultados. 6. Proceder al análisis por citometría de flujo. a. Las muestras deben procesarse a una velocidad de flujo baja para obtener los mejores resultados. Un mayor flujo puede resultar en un % CV más alto para cada compartimento del ciclo celular en el histograma de ADN. b. Los paquetes de software como ModFit LT™ (Verity Software House) o FlowJo™ (FlowJo, LLC) pueden ser útiles para deconvolucionar los histogramas de contenido de ADN en compartimentos del ciclo celular. 7. Nota: Tanto la solución BD Pharmingen™ Hoechst 34580 como la solución BD Pharmingen™ Hoechst 33342 (n.° de cat. 561908) pueden utilizarse indistintamente para la mayoría de las aplicaciones, según el procedimiento de ensayo recomendado para cada colorante. Sin embargo, para el análisis del contenido de ADN, la solución Hoechst 34580 suele ofrecer mejores resultados que la solución Hoechst 33342 para la excitación con láser violeta, y la solución Hoechst 33342 suele ofrecer mejores resultados que la solución Hoechst 34580 para la excitación con láser ultravioleta.
Avisos del producto: Dado que las aplicaciones varían, cada investigador debe titular el reactivo para obtener resultados óptimos. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.