BD, 556405, kit BD Pharmingen™ APO-BRDU™

Aplicación: Citometría de flujo, tinción intracelular (citometría de flujo) (probado durante el desarrollo)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869068
Descripción: Uno de los pasos posteriores de la apoptosis es la fragmentación del ADN, un proceso resultante de la activación de endonucleasas durante el programa apoptótico. Estas nucleasas degradan la estructura de la cromatina de orden superior en fragmentos de ~300 kb y, posteriormente, en fragmentos de ADN más pequeños de aproximadamente 50 pb. Un método frecuente para detectar ADN fragmentado utiliza una reacción catalizada por TdT exógena, a menudo denominada "marcaje final" o "TUNEL" (marcaje de extremos de mella de dUTP con desoxinucleotidiltransferasa terminal). En el ensayo APO-BRDU™, la TdT cataliza una adición independiente del molde de trifosfatos de desoxiuridina bromolados (Br-dUTP) a los extremos 3'-hidroxilo (OH) del ADN bicatenario y monocatenario. Tras la incorporación, estos sitios se identifican mediante citometría de flujo tiñendo las células con un mAb anti-BrdU marcado con FITC. El ensayo APO-DIRECT™ (n.º de cat. 51-6536KK) es un método de un solo paso para marcar roturas de ADN con FITC-dUTP, seguido de un análisis por citometría de flujo. El kit APO-BRDU™ es un método de tinción de dos colores para marcar roturas de ADN y ADN celular total con el fin de detectar células apoptóticas mediante citometría de flujo. Se proporcionan suficientes reactivos para procesar 60 suspensiones celulares. El kit incluye 5 ml de suspensiones celulares de control positivo y 5 ml de control negativo, aproximadamente 1 x 10^6 células por ml en etanol al 70 % (v/v). Las células de control proceden de una línea celular de linfoma humano y se han fijado según lo descrito en el protocolo de fijación. El kit APO-BRDU™ consta de dos partes (parte A y parte B). La Parte A (Comp. No. 51-6576AK) consta de: Un frasco de 0,30 ml de mAb anti-BrdU marcado con FITC [Isotipo: ratón; 1 µg/prueba (contiene 0,05 % de azida sódica)] (Comp. No. 51-6584AZ] Una botella de 30 ml de tampón de tinción PI/RNasa (5 µg/ml, 200 µg/ml de ARNasa) [Comp. No. 51-6585AZ] Un vial de 0,6 ml de tampón de reacción (que contiene ácido cacodílico (dimetilarsénico)) [Comp. No. 51-6580AZ] Una botella de 126 ml de tampón de enjuague (que contiene 0,05 % de azida sódica) [Comp. No. 51-6583AZ] Una botella de 120 ml de tampón de lavado (que contiene 0,05 % de azida sódica) [Comp. No. 51-6579AZ]. La Parte B (Comp. No. 51-6576BK) consta de: Una Frasco de 0,48 ml de Br-dUTP (54,7 µg/ml) [N.º de comp. 51-6582EZ] Un frasco de 5 ml de células de control negativo [contiene etanol al 70 % (v/v)] [N.º de comp. 51-6578LZ] Un frasco de 5 ml de células de control positivo [contiene etanol al 70 % (v/v)] [N.º de comp. 51-6577LZ] Un frasco de 0,045 ml de enzima TdT [200 µg/ml (SA = 100 000 U/mg) en solución de glicerol al 50 % (v/v); no se congela a -20 °C] [N.º de comp. 51-6581EZ]
Preparación y almacenamiento: El kit APO-BRDU™ consta de dos partes (A y B). La parte A (n.º de comp. 51-6576AK) se envía a temperatura ambiente y debe almacenarse a 4 °C a su llegada. La parte B (n.º de comp. 51-6576BK) se envía a –80 °C en hielo seco y debe almacenarse a –20 °C a su llegada. BD Biosciences Pharmingen ha determinado que este método de envío es adecuado para mantener la integridad de los componentes del kit.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados MÉTODOS PARA LA FIJACIÓN, TINCIÓN Y ANÁLISIS DE MUESTRAS DE APO-BRDU™ Protocolo de fijación Este es un protocolo estándar utilizado en BD Biosciences Pharmingen para las pruebas de control de calidad del kit APO-BRDU™. La fijación celular con paraformaldehído es un paso obligatorio en el ensayo APO-BRDU™. El siguiente procedimiento de fijación celular es un método sugerido. Las variables como el origen celular y las condiciones de crecimiento pueden afectar los resultados. Las condiciones de fijación proporcionadas a continuación deben considerarse como directrices. Es posible que se requiera experimentación adicional para obtener resultados comparables a las células de control proporcionadas con este kit. Las células de control positivas y negativas proporcionadas en el kit APO-BRDU™ ya están fijadas. 1. Suspenda las células en paraformaldehído al 1 % (p/v) en PBS (pH 7,4) a una concentración de 1-2 x 10^6 células/ml. 2. Coloque la suspensión celular en hielo durante 30-60 minutos. 3. Centrifugue las células durante 5 minutos a 300 xg y deseche el sobrenadante. 4. Lave las células en 5 ml de PBS y luego sedimente las células por centrifugación. Repita el lavado y la centrifugación. 5. Resuspenda el sedimento celular en el PBS residual en el tubo agitando suavemente el tubo con un vórtex. 6. Ajuste la concentración celular a 1-2 x 10^6 células/ml en etanol al 70% (v/v) helado. Deje reposar las células durante un mínimo de 30 minutos en hielo o en el congelador. Vea la nota a continuación. 7. Almacene las células en etanol al 70% (v/v) a -20 °C hasta su uso. Las células pueden almacenarse a -20 °C varios días antes de su uso. Nota: En algunos sistemas biológicos, el almacenamiento de las células a -20 °C en etanol al 70 % (v/v) durante al menos 12-18 horas antes de la tinción para la detección de apoptosis produce los mejores resultados. Las células se pueden almacenar a -20 °C durante varios meses antes de su uso. Protocolo de tinción El siguiente protocolo describe el método para medir la apoptosis en las células de control positivas y negativas que se proporcionan en el kit APO-BRDU™. Se debe emplear el mismo procedimiento para medir la apoptosis en las muestras de células proporcionadas por el investigador. 1. Resuspenda las células de control positivas (51-6577LZ) y negativas (51-6578LZ) agitando los viales. Retire alícuotas de 1 ml de las suspensiones de células de control (aproximadamente 1 x 10^6 células/ml) y colóquelas en tubos de centrífuga de citometría de flujo de 12 x 75 mm. Centrifugue las suspensiones de células de control durante 5 min a 300 xg y extraiga el etanol al 70 % (v/v) por aspiración, evitando alterar el sedimento celular. 2. Resuspenda cada tubo de células de control con 1,0 ml de tampón de lavado (51-6579AZ). Centrifugue como antes y extraiga el sobrenadante por aspiración. 3. Repita el tratamiento con el tampón de lavado (Paso 2). 4. Resuspenda cada tubo de sedimento de células de control en 50 µl de la solución de marcaje de ADN (preparada como se describe a continuación). Solución de etiquetado de ADN 1 ensayo 5 ensayos 10 ensayos Tampón de reacción (tapa verde) 10,00 µl 50,00 µl 100,00 µl Enzima TdT (tapa amarilla) 0,75 µl 3,75 µl 7,50 µl Br-dUTP (tapa violeta) 8,00 µl 40,00 µl 80,00 µl H2O destilada 32,25 µl 161,25 µl 322,50 µl Volumen total 51,00 µl 255,00 µl 510,00 µl *El volumen adecuado de solución de etiquetado de ADN para preparar una cantidad variable de ensayos se basa en múltiplos de los volúmenes de los componentes necesarios para 1 ensayo. Mezcle solo la solución de marcaje de ADN necesaria para completar el número de ensayos preparados por sesión. La solución de marcaje de ADN permanece activa durante aproximadamente 24 horas a 4 °C. 5. Incube las células en la solución de marcaje de ADN durante 60 minutos a 37 °C en un baño de temperatura controlada. Agite las células cada 15 minutos para resuspenderlas. Nota: La reacción de marcaje de ADN también puede realizarse a temperatura ambiente durante la noche para las células de control. Para muestras distintas a las células de control proporcionadas en el kit, los tiempos de incubación a 37 °C pueden necesitar ajustarse a períodos más largos o más cortos según los requisitos de las células suministradas por el investigador. 6. Al final del tiempo de incubación, agregue 1,0 ml de tampón de enjuague (51-6583AZ) a cada tubo y centrifugue cada tubo a 300 xg durante 5 minutos. Retire el sobrenadante por aspiración. 7. Repita el enjuague celular (como en el paso 6) con 1,0 ml del tampón de enjuague, centrifugue y retire el sobrenadante por aspiración. 8. Resuspenda el sedimento celular en 0,1 ml de la solución de tinción de anticuerpos (preparada como se describe a continuación). 9. Incube las células con la solución de anticuerpo anti-BrdU marcada con FITC en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente. 10. Agregue 0,5 ml del tampón de tinción PI/R Nase (51-6585 AZ) al tubo que contiene los 0,1 ml de solución de tinción de anticuerpos. Solución de tinción de anticuerpos 1 ensayo 5 ensayos 10 ensayos Anti-BrdU marcado con FITC (tapa naranja) 5,00 µl 25,00 µl 50,00 µl Tampón de enjuague (tapa roja) 95,00 µl 475 µl 950,00 µl Volumen total 100,00 µl 500,00 µl 1000 µl Nota: Si la densidad celular es baja, disminuya la cantidad de tampón de tinción de PI/RNasa a 0,3 ml. 11. Incube las células en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente. 12. Analice las células en tampón de tinción de PI/RNasa mediante citometría de flujo. Analice las células dentro de las 3 h posteriores a la tinción para obtener resultados óptimos. Las células pueden comenzar a deteriorarse si se dejan durante la noche antes del análisis. Análisis de muestras de APO-BRDU™ mediante citometría de flujo Este ensayo se realiza en un citómetro de flujo equipado con un láser de argón de 488 nm como fuente de luz. Los resultados esperados utilizando las células de control positivas y negativas se muestran en las figuras 1-3. El yoduro de propidio (PI; ADN celular total) y FITC (células apoptóticas) son los dos colorantes que se utilizan. El PI fluoresce a aproximadamente 623 nm y el FITC a 520 nm cuando se excita a 488 nm. No se requiere compensación de fluorescencia. Se crean dos pantallas de parámetros duales y dos de parámetros simples con el software de adquisición de datos del citómetro de flujo. La pantalla de selección debe ser la pantalla estándar de discriminación de dobletes de ADN de parámetros duales con la señal del área de ADN en el eje Y y el ancho de ADN en el eje X (figura 1). A partir de esta pantalla, se dibuja una selección alrededor de las células no agrupadas y se genera la segunda pantalla de parámetros duales seleccionada. La convención normal de esta visualización es poner el ADN (fluorescencia roja lineal) en el eje X y el FITC-BrdU (fluorescencia verde logarítmica) en el eje Y. También se pueden agregar dos histogramas controlados con un solo parámetro, ADN y FITC-BrdU, pero no son necesarios. Al usar el método de visualización de parámetros duales, no solo se resuelven las células apoptóticas, sino que también se determina su etapa del ciclo celular. CONSEJOS TÉCNICOS Y PREGUNTAS FRECUENTES 1. Para aquellos investigadores que utilizan líneas celulares adherentes, las células en el sobrenadante tienen una mayor probabilidad de ser apoptóticas que las células adherentes. Guarde las células en el sobrenadante para usarlas en el ensayo antes de la tripsinización de la capa de células adherentes. 2. La fijación celular usando un fijador químico de reticulación de ADN (por ejemplo, paraformaldehído) es un paso importante en el análisis de la apoptosis por este método. Las células no fijadas pueden perder fragmentos más pequeños de ADN que no están fijados químicamente en su lugar dentro de la célula antes de los pasos de lavado. El investigador podría tener que explorar métodos alternativos de fijación y permeabilización para explotar completamente sus sistemas. 3. Se puede preparar un portaobjetos de citología por citocentrifugación o centrífuga a partir de la muestra de APO-BRDU™ de la siguiente manera: Después de completar la tinción del anticuerpo anti-BrdU marcado con FITC, pero antes del tratamiento con PI/RNasa, coloque una gota de las células teñidas en un portaobjetos, centrifugúelo y observe la muestra bajo un microscopio de fluorescencia. 4. Para minimizar la pérdida celular durante el ensayo, recomendamos el uso de tubos de poliestireno de 12 x 75 mm durante todo el procedimiento de tinción y el análisis. Con otros tipos de tubos o plásticos (p. ej., polipropileno), las células pueden acumularse en los lados de los tubos, lo que resulta en una pérdida significativa del número de células, así como en una tinción ineficiente de aquellas células que no están completamente expuestas a los reactivos de tinción. También recomendamos que, después de los pasos de lavado, las células se resuspendan mediante una mezcla suave y no mediante pipeteo, ya que las puntas de pipeta de plástico también pueden contribuir a la pérdida celular durante el ensayo. 5. Ocasionalmente, se observa una población de células en espejo con menor intensidad en la visualización de parámetros duales de la citometría de flujo. Esta población surge durante la reacción de marcaje de ADN de 50 µl, cuando algunas células se adhieren a las paredes del tubo de ensayo y no quedan completamente expuestas a la solución de marcaje. Este fenómeno se puede solucionar lavando todas las células de las paredes del tubo y asegurándose de que todas estén correctamente suspendidas al inicio de la reacción de marcaje. 6. Si se observa una baja intensidad de tinción con FITC, intente aumentar el tiempo de incubación durante la reacción de marcaje de ADN de 50 µl. Es posible que se requieran tiempos de marcaje de hasta 4 horas a 37 °C para ciertos sistemas celulares. 7. Si no se requiere información sobre el ciclo celular del ADN, no es necesario añadir el tampón de tinción de PI/RNasa a las muestras. Advertencia: El tampón de reacción (componente 51-6580AZ) contiene 0,2 % de ácido cacodílico (p/p). Indicaciones de peligro: Puede causar cáncer. Declaraciones de precaución: Obtenga instrucciones especiales antes de usar. No manipule hasta que se hayan leído y comprendido todas las precauciones de seguridad. Use ropa protectora / protección para los ojos Use guantes protectores SI está expuesto o es sospechoso: Obtenga consejo / atención médica Almacenar bajo llave. Deseche el contenido / recipiente de acuerdo con las regulaciones locales / regionales / nacionales / internacionales Peligro: Las células de control negativo (componente 51-6578LZ) y las células de control positivo (componente 51-6577LZ) contienen 56,0% de etanol (p / p). Indicaciones de peligro Líquido y vapores altamente inflamables. Provoca irritación ocular grave. Declaraciones de precaución Mantener alejado del calor / chispas / llamas abiertas / superficies calientes. No fumar. Use guantes / ropa protectora / protección para los ojos / protección para la cara. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo): Quítese / Quítese inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuague la piel con agua / dúchese. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuague cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quítese las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Siga enjuagando. Almacenar en un lugar bien ventilado. Mantener en un lugar fresco. Eliminar el contenido/el recipiente de acuerdo con la normativa local, regional, nacional e internacional.
Avisos del producto: Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para consultar los protocolos técnicos.
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