BD, 562253, Kit BD Pharmingen™ para apoptosis, daño del ADN y proliferación celular

Aplicación: Citometría de flujo, tinción intracelular (citometría de flujo) (probado durante el desarrollo)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2869407
Descripción: Descripción Contenido del kit Descripción de los componentes Material N.º Tamaño Almacenamiento Viales Kit Parte A PerCP-Cy5.5 Anti-BrdU de ratón 51-9007682 50 pruebas 4 ºC 1 Alexa Fluor™ 647 Anti-H2AX de ratón (pS139) 51-9007683 50 pruebas 4 ºC 1 PE Anticuerpo de ratón anti-PARP escindido (Asp214) 51-9007684 50 pruebas 4 °C 1 BD Cytofix/Cytoperm™ Solución de fijación/permeabilización 51-2090KE 25 ml 4 °C 1 BD Perm/Wash™ Buffer (10X) 51-2091KE 25 ml 4 °C 2 BD Cytofix/Cytoperm™ Plus Buffer de permeabilización 51-2356KC 10 ml 4 °C 1 DAPI 51-9007681 100 μl 4 °C 1 Kit Parte B BrdU (10 mg/ml) 51-2420KC 5 mg -80 °C 5 DNasa 51-2358KC 300 μl -80 °C 5 Kit de apoptosis, daño del ADN y proliferación celular La citometría de flujo multiparamétrica proporciona una herramienta poderosa para resolver los mecanismos por los cuales las células individuales en poblaciones celulares homogéneas o mixtas mantienen la viabilidad, entran y progresan a través del ciclo celular o experimentan muerte celular. Para este propósito, el kit de apoptosis, daño del ADN y proliferación celular fue diseñado con la inclusión de anticuerpos fluorescentes específicos para BrdU incorporado, H2AX fosforilada (γH2AX) y PARP escindida. Estas sondas, junto con protocolos optimizados, permiten el análisis citométrico de flujo multicolor de la proliferación, el daño al ADN y la apoptosis, respectivamente, en células individuales dentro de las muestras. La tinción inmunofluorescente de células que han incorporado bromodesoxiuridina (BrdU, un análogo de la timidina, precursora del ADN) y el análisis citométrico de flujo proporcionan una técnica de alta resolución para determinar la frecuencia y la naturaleza de las células individuales que han sintetizado ADN. La exposición de células a BrdU en sistemas modelo experimentales, ya sea in vitro o in vivo, permite la incorporación de BrdU mediante el ciclo activo de fracciones celulares. El marcaje de células con pulsos de BrdU en diversos puntos temporales permite la determinación de la cinética del ciclo celular. El análisis citométrico de flujo de la incorporación de BrdU puede combinarse fácilmente con el análisis simultáneo de los niveles celulares de H2AX fosforilada y PARP escindida. La función del H2AX fosforilada es reclutar y localizar proteínas reparadoras del ADN o factores de control del ciclo celular en los sitios dañados del ADN. De esta manera, el H2AX fosforilada promueve la reparación del ADN y mantiene la estabilidad genómica. Las roturas del ADN bicatenario causadas por errores de replicación, apoptosis u otros procesos fisiológicos (incluidas las recombinaciones de genes de inmunoglobulina y TCR) y el daño al ADN causado por radiación ionizante, luz ultravioleta o agentes citotóxicos provocan la fosforilación de H2AX en la serina 139, H2AX (pS139), para inducir su función. PARP (poli [ADP-ribosa] polimerasa) es una enzima asociada a la cromatina nuclear que participa en la reparación del ADN. Durante la apoptosis, la caspasa-3 escinde PARP, lo que resulta en su inactivación y la incapacidad de las células para reparar el daño al ADN. Por esta razón, el fragmento de PARP escindido de 89 kDa sirve como marcador de apoptosis celular.
Preparación y almacenamiento: El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con PerCP-Cy5.5 en condiciones óptimas y se eliminaron el anticuerpo no conjugado y el PerCP-Cy5.5 libre. No se recomienda almacenar los conjugados de PerCP-Cy5.5 en un diluyente no optimizado, ya que puede provocar una pérdida de intensidad de la señal. El anticuerpo se conjugó con el colorante en condiciones óptimas y se eliminó el colorante no reaccionado.
Procedimientos de ensayo recomendados: Reactivos del kit para procedimientos de ensayo recomendados Algunos reactivos del kit se suministran como soluciones madre concentradas y deben diluirse con agua desionizada, PBS de Dulbecco 1X (DPBS) o con tampón de lavado/permeabilización BD. Las instrucciones para la manipulación, preparación y almacenamiento de los componentes del kit son las siguientes: Anticuerpo anti-BrdU de ratón PerCP-Cy5.5. Este vial contiene 250 μl de la solución madre del anticuerpo anti-BrdU PerCP-Cy5.5 que es suficiente para teñir 50 muestras (10^6 células/muestra). Este anticuerpo fluorescente debe almacenarse en la oscuridad a 4 °C. Añada 5 μl de la solución madre del anticuerpo a la muestra. Anticuerpo anti-H2AX (pS139) de ratón Alexa Fluor™ 647. Este vial contiene 250 μl de solución madre del anticuerpo Alexa Fluor™ 647 Anti-H2AX (pS139), suficiente para teñir 50 muestras (10^6 células/muestra). Este anticuerpo fluorescente debe almacenarse en la oscuridad a 4 °C. Añada 5 μl de la solución madre del anticuerpo a la muestra. Anticuerpo PE de ratón anti-PARP escindido (Asp214). Este vial contiene 250 μl de solución madre del anticuerpo conjugado PE anti-PARP escindido (Asp214), suficiente para teñir 50 muestras (10^6 células/muestra). Este anticuerpo fluorescente debe almacenarse en la oscuridad a 4 °C. Añada 5 μl de la solución madre del anticuerpo a la muestra. DAPI (diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol) es un colorante fluorescente para marcar ADN para análisis de citometría de flujo. La solución madre está a 1 mg/ml en agua. Añadir 1 μl de la solución madre de DAPI por ml de tampón de tinción. Se proporciona un vial de DAPI y debe almacenarse en la oscuridad a 4 °C. Tampón de permeabilización BD Cytofix/Cytoperm™ Plus. El tampón de permeabilización BD Cytofix/Cytoperm Plus está especialmente formulado para el kit de apoptosis, daño del ADN y proliferación celular y se utiliza como potenciador de la tinción y reactivo de permeabilización secundario (100 μl/muestra). Se proporciona una botella de 10 ml de tampón BD Cytoperm Plus y debe almacenarse a 4 °C. N ota: El tampón BD Cytoperm Plus debe usarse solo con muestras de células fijadas. El uso de este tampón con células no fijadas causará daño celular. BrdU. Cada vial contiene 0,5 ml de una solución de 10 mg de BrdU/ml (32,5 mM) diluida en DPBS 1X. La solución de BrdU se prepara asépticamente (filtrada a 0,22 μm) y no contiene conservantes; por lo tanto, se recomienda manipularla en condiciones asépticas. Esta solución madre puede inyectarse por vía intraperitoneal (ip) en animales o diluirse a una solución 1 mM para el marcaje in vitro de células. Para el marcaje in vivo de células en ciclado en fase S mediante inyección ip, consulte la sección de marcaje in vivo de la Hoja de datos técnicos (página 4). Para marcar células in vitro, primero diluya la solución madre (10 mg de solución de BrdU/ml) a una solución 1 mM añadiendo 31 μl de la solución madre de BrdU a 1 ml de DPBS 1X o medio de cultivo (esta es una dilución de 32X). Añada 10 μl de la solución de BrdU 1 mM a cada ml de medio de cultivo para obtener una concentración final de 10 μM. El peso molecular de BrdU es 307,1. Se proporcionan cinco viales de solución de BrdU que deben conservarse a -80 °C. Nota: Se ha demostrado que la solución de BrdU es estable hasta 4 meses a 4 °C o puede volver a congelarse. Evite los ciclos múltiples de congelación y descongelación. DNasa. Cada vial contiene 300 μl de una solución de DNasa de 1 mg/ml en DPBS 1X. Al teñir 10 o más muestras, descongele todo el vial de solución de DNasa y añada 700 μl de DPBS 1X para obtener una solución madre de trabajo de 300 μg/ml. Nota: Si se van a tratar menos de 10 muestras con DNasa, tome una alícuota de 30 μl de solución/muestra de DNasa (1 mg/ml) y vuelva a congelar el 1 mg/ml restante de DNasa a -80 °C. Nota: La solución madre de DNasa (es decir, a 1 mg de DNasa/ml) puede volver a congelarse una vez antes de que pierda su actividad. Se utiliza un total de 100 μl de la solución madre de trabajo para tratar cada muestra celular (es decir, 30 μg de DNasa/10^6 células) con incubaciones realizadas a 37 °C. Se proporcionan cinco viales de DNasa que deben almacenarse a -80 °C. Solución de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm™. La solución de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm constituye un reactivo de fijación y permeabilización de un solo paso, diseñado para su uso en tinción intracelular. Contiene una mezcla del fijador paraformaldehído y el detergente saponina. Este reactivo sirve para preservar la morfología celular, fijar las proteínas celulares y permeabilizar las células para la posterior tinción inmunofluorescente de proteínas intracelulares. Se proporciona un frasco de 25 ml de solución de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm listo para usar. Esta solución debe conservarse a 4 °C. Tampón BD Perm/Wash™ (10X). Cada frasco de 25 ml contiene una solución madre concentrada (10X) de tampón BD Perm/Wash. Esta mezcla contiene suero fetal bovino y saponina, el reactivo detergente de permeabilización reversible. El tampón madre concentrado debe diluirse 1:10 con agua desionizada; las porciones no utilizadas del tampón BD Perm/Wash 1X pueden conservarse a 4 °C. Los dos frascos de tampón BD Perm/Wash 10X que se proporcionan deben conservarse a 4 °C. Nota: Es frecuente la presencia de precipitado en el tampón madre BD Perm/Wash 10X. El precipitado no afectará el rendimiento del tampón. Si se desea, el precipitado puede eliminarse antes de usar mediante la filtración del tampón de permeación/lavado BD 1X diluido a través de un filtro de 0,45 μm de poro. Nota: El tampón de permeación/lavado BD (1X) debe usarse solo con muestras de células fijadas. El uso de este tampón en células no fijadas causará daño celular. Nota: La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. Protocolos para el marcado de células con BrdU Marcaje in vitro de células cultivadas y líneas celulares con BrdU Se han informado muchos protocolos diferentes para el marcado de células in vitro con BrdU. Hemos descubierto que la incubación de células con BrdU a una concentración final de 10 μM en medio de cultivo celular (es decir, 10 μl de BrdU 1 mM por ml de medio de cultivo) fue eficaz para marcar una amplia variedad de líneas celulares humanas y de ratón y poblaciones de células normales. La exposición prolongada de células a BrdU permite la identificación de poblaciones celulares de ciclo activo. El marcaje de pulsos de células mediante breves exposiciones a BrdU en varios puntos de tiempo permite la determinación de la cinética del ciclo celular. Para marcar células in vitro, agregue cuidadosamente 10 μl de solución de BrdU (1 mM BrdU en 1X DPBS) directamente a cada ml de medio de cultivo tisular. Para este paso, es importante evitar perturbar las células de cualquier manera (por ejemplo, por pasos de centrifugación o cambios de temperatura) que puedan interrumpir sus patrones normales de ciclo celular. La densidad del cultivo celular no debe exceder 2 × 10^6 células/ml. Las células tratadas se incuban luego durante el tiempo deseado. Para experimentos de marcaje de pulsos, la elección de los puntos de tiempo y la duración del pulso dependen de la tasa de entrada y progresión del ciclo celular de la población de células de prueba. Por ejemplo, un período de tiempo efectivo para pulsar una línea celular que prolifera activamente (p. ej., células CTLL-2) es de 30 a 45 minutos (es decir, cuando las células están en la fase logarítmica de proliferación celular). Los investigadores deben determinar los puntos de tiempo y los intervalos de tiempo de marcaje de pulso que sean óptimos para cada línea celular o población celular diferente dentro de un sistema experimental particular. Las células de la misma población que no están marcadas con BrdU son el control de tinción negativo recomendado para este ensayo. Esto permitirá la determinación de los niveles de tinción de fondo para el anticuerpo monoclonal anti-BrdU. Métodos para el marcaje in vivo de células de ratón con BrdU Dos métodos comunes informados para el marcaje in vivo de células con BrdU incluyen la inyección intraperitoneal (ip) de una solución que contiene BrdU en ratones y la alimentación de ratones con BrdU que se agrega a su agua potable. Sin embargo, tenga en cuenta que estos métodos no se prueban de forma rutinaria en BD Biosciences Pharmingen. Método No. 1: Método para inyectar BrdU por vía intraperitoneal. Se proporciona una solución de 10 mg/ml de BrdU en DPBS 1X estéril para uso in vivo. Inyecte a los ratones ip con 100-200 μl (1-2 mg) de solución de BrdU. La incorporación de BrdU se puede detectar fácilmente en células derivadas del timo y la médula ósea en tan solo 1 hora después de la inyección. Método No. 2: Introducción de BrdU a través del agua de bebida. Diluya BrdU a 0,8 mg/ml en el agua de bebida. La mezcla de BrdU debe prepararse fresca y cambiarse diariamente. La alimentación prolongada de BrdU puede tener efectos tóxicos para el animal. Algunos investigadores han informado efectos letales asociados con 14 días de alimentación continua con BrdU. Para estudios a más largo plazo, algunos investigadores han informado que la alimentación de ratones con BrdU durante 9 días consecutivos seguido de un cambio a agua normal ha funcionado eficazmente. La incorporación de BrdU por las células de estos animales se ha detectado después de 70 días. Protocolo de tinción del kit Apoptosis, daño del ADN y proliferación celular 1. Tinción inmunofluorescente de antígenos de superficie celular. a. Agregar células pulsadas con BrdU (10^6 células en 50 μl de tampón de tinción) a tubos de citometría de flujo. b. Agregar anticuerpos fluorescentes específicos para marcadores de superficie celular en 50 μl de tampón de tinción (p. ej., tampón de tinción BD Pharmingen (FBS) n.º de cat. 554656) por tubo y mezclar bien. c. Incubar las células con anticuerpos durante 15 minutos en hielo. d. Lavar las células 1X agregando 1 ml de tampón de tinción por tubo, centrifugar (5 min) a 200-300 g y desechar el sobrenadante. 2. Fijar y permeabilizar las células con solución de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm. a. Resuspender las células con 100 μl de solución de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm por tubo. b. Incubar las células durante 15-30 minutos a temperatura ambiente o en hielo. c. Lavar las células 1X con 1 ml de tampón de permeación/lavado BD 1X, centrifugar como en el paso 1d y desechar el sobrenadante. 3. Incubar las células con tampón de permeación BD Cytofix/Cytoperm Plus. a. Resuspender las células con 100 μl de tampón de permeación BD Cytofix/Cytoperm Plus por tubo. b. Incubar las células durante 10 minutos en hielo. c. Lavar las células 1X añadiendo 1 ml de tampón de permeación/lavado BD 1X (como en el paso 2c). 4. Re-fijación de las células a. Resuspender las células con 100 μl de solución de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm por tubo. b. Incubar las células durante 5 minutos a temperatura ambiente o en hielo. c. Lavar las células 1X añadiendo 1 ml de tampón de lavado/permeabilización BD 1X (como en el paso 2c). 5. Tratamiento de las células con ADNasa para exponer la BrdU incorporada. a. Resuspender las células con 100 μl de ADNasa diluida (diluida a 300 μg/ml en DPBS) por tubo (es decir, 30 μg de ADNasa por tubo). b. Incubar las células durante 1 hora a 37 °C. c. Lavar las células 1X añadiendo 1 ml de tampón de lavado/permeabilización BD 1X (como en el paso 2c). 6. Teñir BrdU, H2AX (P139), PARP escindida (Asp214) y antígenos intracelulares/de superficie con anticuerpos fluorescentes. a. Resuspender las células con 20 μl de tampón de lavado/permeabilización BD + PerCP-Cy™5.5 anti-BrdU (5 μl/prueba), anticuerpos anti-H2AX (pS139) de ratón Alexa Fluor® 647 (5 μl/prueba), PE anti-PARP escindida (Asp214) (5 μl/prueba) con o sin otros anticuerpos específicos para antígenos intracelulares o de superficie. b. Incubar las células durante 20 minutos a temperatura ambiente. c. Lavar las células 1X añadiendo 1 ml de tampón de lavado/permeabilización BD 1X (como en el paso 2c). 7. Opcional: tinción del ADN total para el análisis del ciclo celular. a. Resuspenda las células con 1 ml de solución DAPI (1 μg/ml). b. Analice las células teñidas con un citómetro de flujo (funcione a una velocidad no mayor de 400 eventos/seg.) y adquiera archivos de datos multiparamétricos. Nota: Si realiza la tinción opcional en el Paso 7, ha terminado y puede continuar con el análisis de sus muestras de células. De lo contrario, continúe con el Paso 8 si no desea la tinción de los niveles totales de ADN. Nota: Las muestras pueden almacenarse durante la noche a 4°C, protegidas de 8. Resuspensión de células para análisis de citometría de flujo. a. Agregue 1 ml de tampón de tinción a cada tubo para resuspender las células. b. Analice las células teñidas con un citómetro de flujo (funcione a una velocidad no mayor de 400 eventos/seg.) y adquiera archivos de datos multiparamétricos. Nota: Las muestras pueden almacenarse durante la noche a 4°C, protegidas de la luz. Controles recomendados para la configuración del instrumento Se recomienda cada anticuerpo individual como control para la configuración del instrumento. 1. PerCP-Cy™5.5 Anti-BrdU (Mostrar en modo logarítmico) 2. PE Anti-PARP escindido (Asp214) (Mostrar en modo logarítmico) 3. Alexa Fluor® 647 Anti-H2AX de ratón (pS139) (Mostrar en modo logarítmico) 4. DAPI (Mostrar en modo lineal) Utilice la autocompensación del software BD FACSDiva™ para compensar el experimento. Para la señal DAPI, seleccione toda la población del histograma de ADN. DAPI se muestra en modo lineal y el pico G0/G1 se establece en el canal 50 000 del histograma. Peligro: La solución de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm™ (componente 51-2090KE) contiene un 4,2 % de formaldehído (p/p). Indicaciones de peligro: Provoca irritación cutánea. Provoca lesiones oculares graves. Puede provocar una reacción alérgica cutánea. Se sospecha que causa defectos genéticos. Puede causar cáncer. Declaraciones de precaución: Obtenga instrucciones especiales antes de usar. No manipule hasta que se hayan leído y comprendido todas las precauciones de seguridad. Use ropa protectora / protección para los ojos. Use guantes protectores. La ropa de trabajo contaminada no debe sacarse del lugar de trabajo. Quítese la ropa contaminada y lávela antes de volver a usarla. Lávese bien después de la manipulación. No respire la niebla/los vapores/el aerosol. EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclare cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quítese las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Siga aclarando. Si se produce irritación o sarpullido en la piel: Consulte a un médico. EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lave con abundante agua. EN CASO DE exposición o sospecha de exposición: Consulte a un médico. Evite su liberación al medio ambiente. Almacene bajo llave. Deseche el contenido/el recipiente en una instalación de tratamiento y eliminación adecuada de acuerdo con las leyes y regulaciones aplicables y las características del producto en el momento de la eliminación. Peligro. BrdU (componente 51-2420KC) contiene 0,98 % de 5-bromo-2ʹ-desoxiuridina (p/p). Indicación de peligro: Puede causar defectos genéticos. Se sospecha que daña la fertilidad o al feto. Consejos de precaución: Obtenga instrucciones especiales antes de usar. No lo manipule hasta haber leído y comprendido todas las precauciones de seguridad. Use guantes/ropa/protección ocular/protección facial. EN CASO DE exposición o sospecha: Consulte a un médico. Almacenar bajo llave. Deseche el contenido/el recipiente en una planta de tratamiento y eliminación adecuada, de acuerdo con las leyes y normativas aplicables y las características del producto en el momento de la eliminación.
Avisos del producto: Avisos del producto Este reactivo ha sido prediluido para su uso al volumen recomendado por prueba. Normalmente usamos 1 × 10^6 células en una muestra experimental de 100 µl (una prueba). La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en los Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Observe las siguientes precauciones: La absorción de luz visible puede alterar significativamente la transferencia de energía que ocurre en cualquier conjugado de fluorocromo en tándem; por lo tanto, recomendamos que se tomen precauciones especiales (como envolver viales, tubos o gradillas en papel de aluminio) para evitar la exposición de los reactivos conjugados, incluidas las células teñidas con esos reactivos, a la iluminación ambiental. Los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 pueden utilizarse con reactivos marcados con FITC y R-PE en citómetros de flujo de láser único sin superposición espectral significativa de la fluorescencia de PerCP-Cy5.5, FITC y R-PE. PerCP-Cy5.5 está optimizado para su uso con un láser de iones de argón que emite luz de 488 nm. Debido al amplio espectro de absorción del fluorocromo en tándem, se debe tener especial cuidado al utilizar citómetros de láser dual, ya que pueden excitar directamente tanto PerCP como Cy5.5™. Recomendamos el uso de compensación de haz cruzado durante la adquisición de datos o compensación de software durante el análisis de datos. Para conocer los espectros de fluorocromos y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web sobre citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Antes de teñir con este reactivo, confirme que su citómetro de flujo sea capaz de excitar el fluorocromo y discriminar la fluorescencia resultante. Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Este producto se proporciona bajo una licencia de propiedad intelectual entre Life Technologies Corporation y BD Businesses. La compra de este producto le otorga al comprador el derecho intransferible de usar la cantidad comprada del producto y los componentes del producto en la investigación realizada por el comprador (ya sea una entidad académica o con fines de lucro). El comprador no puede vender ni transferir de otro modo (a) este producto (b) sus componentes o (c) materiales elaborados con este producto o sus componentes a un tercero ni utilizar de otro modo este producto o sus componentes o materiales elaborados con este producto o sus componentes para fines comerciales. Los fines comerciales se refieren a cualquier actividad realizada por una parte a cambio de una contraprestación y pueden incluir, entre otros: (1) el uso del producto o sus componentes en la fabricación; (2) el uso del producto o sus componentes para proporcionar un servicio, información o datos; (3) el uso del producto o sus componentes con fines terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos; o (4) la reventa del producto o sus componentes, independientemente de si dicho producto o sus componentes se revenden para su uso en investigación. Para obtener información sobre la adquisición de una licencia de este producto para cualquier otro uso, comuníquese con Life Technologies Corporation, Cell Analysis Business Unit Business Development, 29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, EE. UU., Tel.: (541) 465-8300. Fax: (541) 335-0504. Consulte http://regdocs.bd.com para acceder a las fichas de datos de seguridad (FDS). Alexa Fluor™ es una marca comercial de Life Technologies Corporation. Cy es una marca comercial de Global Life Sciences Solutions Germany GmbH o de una filial que opera como Cytiva.
Descripción: Cantidad/Tamaño: Número de pieza: ID de EntrezGene
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