BD, 640178, Kit de ensayo de calcio BD™

Aplicación: Ensayo funcional (probado rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
Descripción: El kit de ensayo de calcio BD™ permite la medición homogénea de los cambios de calcio intracelular causados ​​por la activación de receptores acoplados a proteína G o canales de calcio. El ensayo solo requiere la adición de un colorante y no requiere lavado, lo que facilita su implementación en entornos de alto rendimiento. Componente: Indicador de calcio - 10 viales, liofilizado. Potenciador de señal (10x) - 100 mL.
Preparación y almacenamiento: Preparación y almacenamiento El indicador de calcio debe protegerse de la luz y almacenarse a -20 °C. El potenciador de señal 10X debe almacenarse a temperatura ambiente.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados PROTOCOLO DE ENSAYO DE FLUJO DE CALCIO Nota. Termine de leer todo el protocolo antes de comenzar el experimento. Materiales no incluidos 100% DMSO Sigma D4540 Probenecid (opcional) Sigma P8761 PREPARACIÓN DE CÉLULAS El número de células debe optimizarse para cada ensayo. Las condiciones óptimas del ensayo requieren una monocapa confluente de células antes del ensayo. -Para células adherentes, sembrar de 50 000 a 70 000 células/pocillo para una placa de 96 pocillos y de 12 000 a 20 000 células/pocillo para una placa de 384 pocillos el día antes del experimento. Añadir 100 µl/pocillo de suspensión celular a placas de 96 pocillos o 25 µl/pocillo a placas de 384 pocillos, dejar que las células se adhieran y crezcan durante la noche durante 16 a 24 horas en incubadoras de cultivo celular. Antes de cargar la placa con el colorante, examinar las células para comprobar la confluencia y la salud general. -Para células no adherentes, dispense 100 µl/pocillo de células en medio de cultivo a placas de 96 pocillos o 25 µl/pocillo a placas de 384 pocillos recubiertas con poli-D lisina u otra ECM un par de horas antes del experimento. Deje que las células se asienten y se adhieran al fondo de las placas a temperatura ambiente. Centrifugue brevemente con el freno quitado antes del experimento. PREPARACIÓN de la SOLUCIÓN DE CARGA DE COLORANTE 1X 1. Retire un vial de Indicador de Calcio de -20 °C y deje reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos para que se caliente. Agregue 100 µl de DMSO al 100%, reconstituya el pellet pipeteando arriba y abajo varias veces. Nota. Para solubilizar completamente el Indicador de Calcio, mantenga el Indicador de Calcio reconstituido a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de la preparación de la solución de carga de colorante 1X. 2. Para preparar 1X PBX Signal Enhancer, transfiera 10 ml de 10X PBX Signal Enhancer a 90 ml de tampón de ensayo de calcio 1X, mezcle bien. Nota. El probenecid no es esencial para la carga de colorante, aunque a menudo mejora la retención del colorante en las células. Para las células que requieren probenecid para la carga (p. ej., CHO), prepare una solución madre de probenecid fresca en NaOH 1N y luego diluya la solución madre en 1X PBX Signal Enhancer a una concentración de 1 mM a 5 mM si lo desea. 3. Para preparar la solución de carga de colorante 1X para una placa de células, pipetee 10 ml de 1X PBX Signal Enhancer a un tubo aparte, añada 10 µl de indicador de calcio a 10 ml de 1X PBX Signal Enhancer, mezcle invirtiendo el tubo varias veces. 4. Divida en alícuotas el indicador de calcio no utilizado en varios tubos de microcentrífuga, séllelos herméticamente y consérvelos a -20 °C. 1X PBX Signal Enhancer podría almacenarse a temperatura ambiente. Nota. El indicador de calcio reconstituido es estable durante más de un mes si el tubo está sellado herméticamente. Para obtener mejores resultados, coloque los tubos en una bolsa de plástico con cierre hermético con desecante y evite ciclos repetitivos de congelación y descongelación. CARGA DE COLORANTE 1. Retire las placas de células de la incubadora y agregue un volumen igual de solución de carga de colorante 1 X a cada pocillo (por ejemplo, 100 l a 100 l de medio de cultivo/pocillo para placas de 96 pocillos, o 25 l a 25 l de medio de cultivo/pocillo para placas de 384 pocillos). Nota. Los componentes del kit no tienen interferencia con el suero o el rojo fenol. Sin embargo, para algunos ensayos que requieren un entorno libre de suero, el medio de cultivo que contiene suero debe retirarse antes de la carga del colorante y reemplazarse con un volumen igual de solución de carga de colorante 0,5X. La solución de carga de colorante 1x es estable durante 8 a 12 horas a temperatura ambiente y 2-3 semanas a -20 °C. 2. Incube las placas celulares con el colorante durante 1 hora en una incubadora de cultivo celular. Nota. Si el ensayo de flujo de calcio se va a realizar a temperatura ambiente, coloque las placas celulares a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos para que se enfríen antes de colocar las placas en los lectores. Si el ensayo de flujo de calcio requiere 37 °C, realice el ensayo inmediatamente después de la carga del colorante. ENSAYO DE FLUJO DE CALCIO Coloque las placas celulares en un FLIPR, FlexStation o FDSS y realice el ensayo de flujo de calcio como se describe en los manuales de instrumentación. Para los ensayos realizados en un FlexStation, utilice los siguientes parámetros de longitud de onda: Excitación: 485 nm Emisión: 525 nm AutoCutoff: activado (515 nm) Para los ensayos realizados en un FLIPR y un FDSS, utilice los filtros estándar para ensayos de calcio. Nota. La velocidad y la altura de dispensación para las adiciones de compuestos deben optimizarse para cada ensayo. En general, se recomienda una velocidad de dispensación superior a la configuración para otros ensayos de flujo de calcio. GUÍA DE SOLUCIÓN DE PROBLEMAS 1. Señal fluorescente basal baja " Inspeccione la densidad celular y la morfología con un microscopio. Una densidad celular baja o células enfermas podrían resultar en una señal basal baja. " Verifique el almacenamiento del indicador de calcio. El indicador de calcio debe almacenarse en un tubo hermético congelado con desecante. Una vez reconstituido, se deben evitar los ciclos repetidos de congelación y descongelación. " Asegúrese de que el indicador de calcio esté bien mezclado con el potenciador de señal PBX 1X antes de cargar el colorante. 2. Respuesta al agonista menor de lo esperado " Verifique la salud general de las células. " La densidad celular es demasiado alta o demasiado baja. Puede ser necesaria la titulación del número de células. 3. Variaciones entre pocillos después de la adición del agonista. " Optimice la altura y la velocidad de dispensación para las adiciones de ligando para asegurar una mezcla instantánea. Las células deben estar distribuidas uniformemente entre los pocillos. Antes de sembrar, examine el cultivo al microscopio para asegurarse de que se haya fragmentado en células individuales. Las células agrupadas responden con mayor variabilidad. Compruebe la precisión de la dosificación del sistema de manejo de líquidos. 4. Respuesta de las células tras la adición del tampón. Las células enfermas podrían responder a la adición del tampón. Asegúrese de que las células no estén demasiado confluentes ni enfermas antes de sembrar. Las células se ven afectadas por la alta velocidad de adición del compuesto. Ajuste la velocidad y la altura de pipeteo correctamente para evitar la estimulación de las células por fuerzas físicas durante la adición del compuesto. 5. Respuesta de las células tras la adición del tampón que contiene solo DMSO. Si el experimento de flujo de calcio se realiza a temperatura ambiente, deje que las placas celulares se equilibren a temperatura ambiente durante un período más largo (p. ej., una hora) después de la carga del colorante a 37 grados. Deje que las células se adapten a un entorno de DMSO antes de la adición del fármaco añadiendo DMSO en la solución de carga del colorante (ligeramente menos que la concentración final de DMSO tras la adición del fármaco).