BD, 560210, BD Pharmingen™ Alexa Fluor® 555 Anti-BrdU de ratón

Nombre alternativo: 5-bromo-2'-desoxiuridina, 5-bromouracilo desoxirribosido, BUdR
Isotipo: IgG1 de ratón, κ
Aplicación: Bioimagen (Probada rutinariamente)
Vol. por prueba: 5 µl
ID de registro: AB_1645614
Tampón de almacenamiento: Solución tamponada acuosa que contiene BSA y ≤0,09 % de azida sódica.
Estado regulatorio: RUO
Preparación y almacenamiento: Conservar sin diluir a 4 °C y protegido de la luz. No congelar. El anticuerpo monoclonal se purificó a partir del sobrenadante de cultivo tisular o de la ascitis mediante cromatografía de afinidad. El anticuerpo se conjugó con el colorante en condiciones óptimas y se eliminó el colorante no reaccionado.
Procedimientos de ensayo recomendados: Las células se marcan con pulsos de BrdU, se fijan para mantener la carga de BrdU y se permeabilizan para la tinción intranuclear del BrdU incorporado. Se utiliza DNasa I para escindir aleatoriamente el ADN, lo que permite que el anticuerpo monoclonal anti-BrdU se una al BrdU incorporado. Materiales • Cultivo celular adherente en una placa de imágenes BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353219) • Incubadora a 37 °C • BrdU (n.º de cat. 550891) diluido a 10-100 μM en medio de cultivo tisular; prepare suficiente para usar a 50 μl por pocillo (consulte el paso 1 del procedimiento) • Tampón de fijación BD Cytofix™ (n.º de cat. 554655), calentado a 37 °C • Tampón de permeación BD™ Phosflow III (n.º de cat. 558050), a -20 °C • Solución salina tamponada con fosfato (PBS), a temperatura ambiente • Tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) (n.º de cat. 554656), a 4 °C • Solución estéril de 300 μg/ml de ADNasa I (preferiblemente, Sigma-Aldrich Cat. N.° D4513) en PBS, prepare suficiente para usar a razón de 50 μl por pocillo. • Anticuerpo monoclonal de ratón anti-BrdU Alexa Fluor® 555 diluido 1:10 en tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS), prepare suficiente para usar a razón de 50 μl por pocillo. Si se van a usar anticuerpos adicionales, agréguelos de forma que todos los anticuerpos estén incluidos en los 50 μl por pocillo. • Solución de 2 μg/ml de Hoechst 33342 (p. ej., Sigma-Aldrich Cat. No. B2261) en PBS, prepare suficiente para usar a 100 μl por pocillo • Instrumento de imágenes de fluorescencia capaz de excitar Alexa Fluor® 555 y Hoechst 33342, como el sistema de bioimágenes BD Pathway™ Procedimiento 1. Pulse los cultivos celulares adherentes añadiendo 50 μl de BrdU diluido a cada pocillo e incubando durante 1-2 horas a 37 °C. Omita la BrdU de los pocillos que se utilizarán como controles negativos para la tinción de BrdU. En todos los pasos posteriores, las células cargadas con BrdU y las células de control deben procesarse en paralelo. 2. Retire el medio de los pocillos y fije las células añadiendo 100 μl del tampón de fijación precalentado a cada pocillo e incubándolos durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente. 3. Retire el fijador de los pocillos y lave los pocillos dos veces con 100 μl de PBS. 4. Retire el PBS y permeabilice las células añadiendo 100 μl de BD™ Phosflow Perm Buffer III helado a cada pocillo e incubándolos durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. 5. Retire el Perm Buffer III de los pocillos y lave los pocillos dos veces con 100 μl de PBS. 6. OPCIONAL: Retire el PBS y bloquee las células añadiendo 100 μl de BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) a cada pocillo e incubándolos durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. 7. Retire el tampón de tinción BD Pharmingen™ (FBS) y desnaturalice el ADN de las células añadiendo 50 μl de solución estéril de DNasa I a cada pocillo e incubándolo durante 1 hora a 37 °C. 8. Retire la solución de DNasa I de los pocillos y lávelos una vez con 100 μl de PBS. 9. Retire el PBS y tiña las células añadiendo 50 μl de solución de anticuerpo diluido a cada pocillo e incubándolo durante 1 hora a temperatura ambiente. 10. Retire la solución de anticuerpo y lave los pocillos dos veces con 100 μl de PBS. 11. Retire el PBS y contratine los núcleos añadiendo 100 μl de solución Hoechst 33342 a cada pocillo al menos 15 minutos antes de la obtención de imágenes. 12. Observe y analice las células en un instrumento de obtención de imágenes adecuado. Los filtros recomendados para los analizadores de células BD Pathway™ son: Instrumento Excitación Emisión Dicroico BD Pathway 855 548/20 570LP Fura/FITC BD Pathway 435 543/22 593/40 FF562
Avisos del producto: Avisos del producto Consulte www.bdbiosciences.com/us/s/resources para conocer los protocolos técnicos. Este reactivo ha sido prediluido para su uso al volumen recomendado por prueba cuando se sigue el procedimiento de ensayo recomendado. Una prueba suele consistir en ~10 000 células cultivadas en un pocillo de una placa de imágenes de 96 pocillos. La fuente de todas las proteínas séricas proviene de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Para conocer los espectros de fluorocromo y la configuración adecuada del instrumento, consulte nuestra página web de citometría de flujo multicolor en www.bdbiosciences.com/colors. Este producto se proporciona bajo una licencia de propiedad intelectual entre Life Technologies Corporation y BD Businesses. La compra de este producto le otorga al comprador el derecho intransferible de usar la cantidad comprada del producto y los componentes del producto en la investigación realizada por el comprador (ya sea que el comprador sea una entidad académica o con fines de lucro). El comprador no puede vender ni transferir de otra manera (a) este producto (b) sus componentes o (c) materiales hechos usando este producto o sus componentes a un tercero ni usar de otra manera este producto o sus componentes o materiales hechos usando este producto o sus componentes para Fines Comerciales. Fines Comerciales significa cualquier actividad realizada por una parte a cambio de una contraprestación y puede incluir, pero no está limitado a: (1) uso del producto o sus componentes en la fabricación; (2) uso del producto o sus componentes para proporcionar un servicio, información o datos; (3) uso del producto o sus componentes para fines terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos; o (4) reventa del producto o sus componentes, ya sea que dicho producto o sus componentes se revendan o no para su uso en investigación. Para obtener información sobre la adquisición de una licencia de este producto para cualquier otro uso, comuníquese con Life Technologies Corporation, Unidad de Análisis Celular, Desarrollo de Negocios, 29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, EE. UU., Tel.: (541) 465-8300. Fax: (541) 335-0504. Alexa Fluor™ es una marca registrada de Life Technologies Corporation.