BD, 550319, equipo ELISA para IL-6 de rata BD OptEIA™

Reactividad: Rata (Prueba de control de calidad)
Aplicación: ELISA (probado de forma rutinaria)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2868879
Descripción: Descripción Materiales proporcionados El set OptEIA™ para interleucina-6 (IL-6) de rata contiene los componentes necesarios para desarrollar ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para IL-6 de rata natural o recombinante en suero, plasma y sobrenadantes de cultivos celulares. Se proporcionan suficientes materiales para producir aproximadamente 20 placas de 96 pocillos si se siguen el almacenamiento, los materiales, la preparación del tampón y el procedimiento de ensayo recomendados según lo especificado en este paquete. Optimización del ensayo Los sets BD OptEIA™ permiten un diseño de ensayo flexible para adaptarse a las necesidades individuales del laboratorio. Para diseñar un inmunoensayo con diferente sensibilidad y rango dinámico, se pueden variar los siguientes parámetros: captura, títulos de anticuerpos de detección, tiempo de incubación, temperatura de incubación, formulación del diluyente de ensayo, pH del tampón, fuerza iónica, concentración de proteínas, tipo de sustrato, técnica de lavado (es decir, número de repeticiones de lavado y tiempos de remojo) Estandarización: este inmunoensayo está calibrado contra IL-6 de rata recombinante purificada.
Preparación y almacenamiento: Conservar los reactivos sin abrir a 2-8 °C. No utilizarlos después de su fecha de caducidad o si presentan turbidez. Antes de usar, dejar todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25 °C). Inmediatamente después de su uso, almacenar en las condiciones adecuadas. Los estándares liofilizados son estables hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, alicuotar inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 µl por vial y congelar a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, conservar a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alicuotar/congelar. No dejar el estándar reconstituido a temperatura ambiente.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Tampones y soluciones recomendados Nota: No utilice azida sódica en estas preparaciones. La azida sódica inactiva la enzima peroxidasa de rábano picante. Se recomienda el BD OptEIA. Juego de reactivos B (n.º de cat. 550534) que contiene tampón de recubrimiento, diluyente de ensayo, reactivos de sustrato A y B, solución de parada y concentrado de tampón de lavado 20X. 1. Tampón de recubrimiento: carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,5; 7,13 g de NaHCO3, 1,59 g de Na2CO3; cs a 1,0 L; pH a 9,5 con NaOH 10 N. Preparar en el momento o utilizar en un plazo de 7 días desde su preparación, almacenado a 2-8 °C. 2. Diluyente de ensayo: PBS* con FBS# al 10 %, pH 7,0. BD Pharmingen. Se recomienda el diluyente de ensayo (n.° de cat. 555213). *Solución salina tamponada con fosfato: 80,0 g de NaCl, 11,6 g de Na₂HPO₃, 2,0 g de KH₂PO₃, 2,0 g de KCl, cs a 10 l; pH a 7,0. #Suero fetal bovino: Se recomienda Hyclone n.° de cat. SH30088 (inactivado por calor). Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con almacenamiento a 2-8 °C. 3. Tampón de lavado: PBS* con Tween-20 al 0,05 %. Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con almacenamiento a 2-8 °C. 4. Solución de sustrato: tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. Se recomienda el kit de reactivos de sustrato TMB de BD Pharmingen (n.° de cat. 555214). 5. Solución de parada: 1 M H3PO4 o 2 N H2SO4 Materiales adicionales necesarios 1. BD Falcon de 96 pocillos. Se recomiendan placas ELISA (n.º de cat. 353279) 2. Lector de microplacas capaz de medir la absorbancia a 450 nm 3. Pipetas de precisión 4. Probeta, un litro 5. Agua desionizada o destilada 6. Frasco de lavado o lavador automático 7. Papel milimetrado logarítmico o reducción automática de datos 8. Tubos para preparar diluciones estándar 9. Temporizador de laboratorio 10. Selladores de placas o parafilm Recolección y manejo de muestras: Las muestras deben ser transparentes, no hemolizadas y no lipémicas. Sobrenadantes de cultivo celular: Retire cualquier material particulado mediante centrifugación y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Suero: Use un tubo separador de suero y permita que las muestras coagulen durante 30 minutos, luego centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g. Retire el suero y analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Plasma: recolecte el plasma usando citrato, EDTA o heparina como anticoagulante. Centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Analice inmediatamente o almacene las muestras a ≤ -20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación. Preparación y manejo de estándares 1. Reconstitución: Después de calentar el estándar liofilizado a temperatura ambiente, abra cuidadosamente el vial para evitar la pérdida de material. Reconstituya el estándar liofilizado con 1,0 mL de agua desionizada para obtener un estándar madre. Deje que el estándar se equilibre durante al menos 15 minutos antes de realizar diluciones. Agite suavemente con vórtex para mezclar. 2. Almacenamiento/manipulación del estándar reconstituido: Tras la reconstitución, alicuote inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 µl por vial y congélela a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, consérvela a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alicuotarla/congelarla. No deje el estándar reconstituido a temperatura ambiente. 3. Preparación de los estándares para el ensayo: a. Prepare un estándar de 5000 pg/mL a partir de la solución madre del estándar. Mezcle con vórtex. (Consulte las instrucciones de dilución en el certificado de instrucciones/análisis). b. Añada 300 µL de diluyente de ensayo a 6 tubos. Etiquete como 2500 pg/mL, 1250 pg/mL, 625 pg/mL, 313 pg/mL, 156 pg/mL y 78 pg/mL. c. Realice diluciones seriadas añadiendo 300 µL de cada estándar al siguiente tubo y agitando con vórtex entre cada transferencia. El diluyente de ensayo sirve como estándar cero (0 pg/mL). Procedimiento detallado del ensayo: 1. Recubra los micropocillos con 100 µL por pocillo de anticuerpo de captura diluido en tampón de recubrimiento. Para la dilución de recubrimiento recomendada del anticuerpo, consulte las instrucciones/certificado de análisis específicos del lote. Selle la placa e incube durante la noche a 4 °C. 2. Aspire los pocillos y lave 5 veces con ≥ 300 µL/pocillo de tampón de lavado. Después del último lavado, invierta la placa y seque con papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual. 3. Bloquee las placas con ≥ 200 µL/pocillo de diluyente de ensayo. Incube a temperatura ambiente durante 1 hora. 4. Aspire/lave como en el paso 2. 5. Prepare las diluciones del estándar y de la muestra en diluyente de ensayo. Consulte "Preparación y manipulación de estándares". 6. Pipetee 100 µL de cada estándar, muestra y control en los pocillos apropiados. Selle la placa e incube durante 2 horas a TA. 7. Aspire/lave como en el paso 2, pero con 5 lavados en total. 8. Agregue 100 µL de Anticuerpo de Detección diluido a cada pocillo. Selle la placa e incube durante 1 hora a TA. 9. Aspire/lave como en el paso 2, pero con 5 lavados en total. 10. Agregue 100 µL de Reactivo Enzimático diluido (SAv-HRP) a cada pocillo. Selle la placa e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. 11. Aspire/lave como en el paso 2, pero con 7 lavados en total. NOTA: En este paso de lavado final, sumerja los pocillos en tampón de lavado durante 30 segundos a 1 minuto para cada lavado. 12. Agregue 100 µL de Solución de Sustrato TMB a cada pocillo. Incubar la placa (sin sellador de placa) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. 13. Agregar 50 µL de solución de parada a cada pocillo. 14. Leer la absorbancia a 450 nm dentro de los 30 minutos de detener la reacción. Si la corrección de longitud de onda está disponible, restar la absorbancia a 570 nm de la absorbancia a 450 nm. Resumen del procedimiento de ensayo 1. Agregar 100 µL de Ab de captura diluido a cada pocillo. Incubar durante la noche a 4 °C 2. Aspirar y lavar 5 veces. 3. Bloquear las placas: 200 µL de diluyente de ensayo a cada pocillo. Incubar 1 hora a temperatura ambiente 4. Aspirar y lavar 5 veces. 5. Agregar 100 µL de estándar o muestra a cada pocillo. Incubar 2 horas a temperatura ambiente. 6. Aspirar y lavar 5 veces. 7. Agregar 100 µL de Ab de detección diluido a cada pocillo. Incubar 1 h RT 8. Aspirar y lavar 5 veces 9. Añadir 100 µL de SAv-HRP diluido a cada pocillo. Incubar 30 min RT. 10. Aspirar y lavar 7 veces (con remojos de 30 s a 1 min) 11. Añadir 100 µL de solución de sustrato TMB a cada pocillo. Incubar 30 min RT en oscuridad 12. Añadir 50 µL de solución de parada a cada pocillo. Leer a 450 nm en 30 min con corrección λ 570 nm. Cálculo de resultados Calcular la absorbancia media para cada conjunto de estándares, controles y muestras duplicados. Restar la absorbancia media del estándar cero de cada uno. Graficar la curva estándar en papel milimetrado logarítmico, con la concentración de IL-6 en el eje x y la absorbancia en el eje y. Dibujar la curva de mejor ajuste a través de los puntos estándar. Para determinar la concentración de IL-6 de las incógnitas, encuentre el valor de absorbancia media de la incógnita en el eje y y trace una línea horizontal hacia la curva estándar. En el punto de intersección, trace una línea vertical hacia el eje x y lea la concentración de IL-6. Si las muestras se diluyeron, multiplique la concentración de IL-6 por el factor de dilución. También se puede emplear la reducción de datos computarizados, utilizando el análisis de regresión logarítmica. Especificidad Reactividad cruzada: Los siguientes factores se probaron en el ensayo BD OptEIA a ≥ 10 ng/mL y no se identificó reactividad cruzada (valor ≥ 4 pg/mL). Humano recombinante: IL-6 Ratón recombinante: IL-6 Rata recombinante: IL-2, IL-4, IL-10, GM-CSF, IFN-γ, TNF Limitaciones del procedimiento · Las muestras que generan valores de absorbancia más altos que la curva estándar se deben diluir con diluyente estándar y volver a analizar. No se ha investigado exhaustivamente la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede descartar la posibilidad de interferencia. Los sets BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del set. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este set.
Avisos del producto: Avisos del producto Para obtener capacitación en línea sobre las técnicas ELISA del conjunto BD OptEIA™, consulte http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. Los conjuntos BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del conjunto. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este conjunto. Los reactivos que contienen conservantes pueden ser tóxicos si se ingieren, inhalan o entran en contacto con la piel. Manipule todas las muestras de suero y plasma de acuerdo con las directrices del NCCLS para prevenir la transmisión de infecciones transmitidas por la sangre. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company.
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