BD, 550948, Conjunto ELISA BD OptEIA™ Human CD253 (TRAIL)

Reactividad: Humana (Pruebas de control de calidad)
Aplicación: ELISA, captura ELISA, detección ELISA (probada rutinariamente)
Estado regulatorio: RUO
ID de registro: AB_2868911
Descripción: Descripción El set OptEIA™ para el ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) humano contiene los componentes necesarios para desarrollar ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para TRAIL humano natural o recombinante en suero, plasma y sobrenadantes de cultivos celulares. Se proporcionan materiales suficientes para producir aproximadamente 20 placas de 96 pocillos si se siguen las recomendaciones de almacenamiento, materiales, preparación del tampón y procedimiento de ensayo que se especifican en este paquete. Optimización del ensayo Los sets BD OptEIA™ permiten un diseño de ensayo flexible para adaptarse a las necesidades individuales del laboratorio. Para diseñar un inmunoensayo con diferente sensibilidad y rango dinámico, se pueden variar los siguientes parámetros: captura, títulos de anticuerpos de detección, tiempo de incubación, temperatura de incubación, formulación del diluyente de ensayo, pH del tampón, fuerza iónica, concentración de proteínas, tipo de sustrato, técnica de lavado (es decir, número de repeticiones de lavado y tiempos de remojo). Estandarización: este inmunoensayo está calibrado frente a TRAIL humano recombinante purificado.
Preparación y almacenamiento: Conservar los reactivos sin abrir a 2-8 °C. No utilizarlos después de su fecha de caducidad o si presentan turbidez. Antes de usar, dejar todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25 °C). Inmediatamente después de su uso, almacenar en las condiciones adecuadas. Los estándares liofilizados son estables hasta la fecha de caducidad. Tras la reconstitución, alicuotar inmediatamente la solución madre del estándar en viales de polipropileno a 50 µl por vial y congelar a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, conservar a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alicuotar/congelar. No dejar el estándar reconstituido a temperatura ambiente.
Procedimientos de ensayo recomendados: Procedimientos de ensayo recomendados Tampones y soluciones recomendados Nota: No utilice azida sódica en estas preparaciones. La azida sódica inactiva la enzima peroxidasa de rábano picante. Se recomienda el juego de reactivos BD OptEIA™ B (n.º de cat. 550534) que contiene tampón de recubrimiento, diluyente de ensayo, reactivos de sustrato A y B, solución de parada y concentrado de tampón de lavado 20X. 1. Tampón de recubrimiento: carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,5; 7,13 g de NaHCO3, 1,59 g de Na2CO3; cs a 1,0 L; pH a 9,5 con NaOH 10 N. Preparar en el momento o utilizar en un plazo de 7 días desde su preparación, almacenado a 2-8 °C. 2. Diluyente de ensayo: PBS* con 10 % de FBS#, pH 7,0. Se recomienda el diluyente de ensayo BD Pharmingen™ (n.° de cat. 555213). *Solución salina tamponada con fosfato: 80,0 g de NaCl, 11,6 g de Na₂HPO₄, 2,0 g de KH₂PO₄, 2,0 g de KCl, cs a 10 l; pH a 7,0. #Suero fetal bovino: Se recomienda Hyclone n.° de cat. SH30088 (inactivado por calor). Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, con conservación a 2-8 °C. 3. Tampón de lisis: 10 mM de Tris pH 7,5, 130 mM de NaCl, 1 % de Triton-X100, 10 mM de NaF, 10 mM de NaPi, 10 mM de NaPPi. Se recomienda el tampón de lisis de células de insecto BD Pharmingen™ (n.° de cat. 554778). 4. Cóctel inhibidor de proteasa: se recomienda el cóctel inhibidor de proteasa BD Pharmingen™ (n.° de cat. 554779). Cóctel inhibidor de proteasa 50X: 800 µg/ml de clorhidrato de benzamidina, 500 µg/ml de fenantrolina, 500 µg/ml de aprotinina, 500 µg/ml de leupeptina, 500 µg/ml de pepstatina A, 50 mM de PMSF. 5. Tampón de lavado: PBS* con Tween-20 al 0,05 %. Preparar en el momento o usar en los 3 días siguientes a su preparación, conservando a 2-8 °C. 6. Solución de sustrato: tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno. Se recomienda el juego de reactivos de sustrato BD Pharmingen™ TMB (n.º de cat. 555214). 7. Solución de parada: H3PO4 1 M o H2SO4 2 N Materiales adicionales necesarios 1. Se recomiendan placas ELISA BD Falcon™ de 96 pocillos (n.º de cat. 353279) 2. Lector de microplacas capaz de medir la absorbancia a 450 nm 3. Pipetas de precisión 4. Probeta de un litro 5. Agua desionizada o destilada 6. Frasco de lavado o lavador automático 7. Papel milimetrado logarítmico o reducción de datos automática 8. Tubos para preparar diluciones estándar 9. Temporizador de laboratorio 10. Selladores de placas o parafilm Recolección y manejo de muestras: Las muestras deben ser transparentes, no hemolizadas y no lipémicas. Lisado celular: Ver "Preparación de la muestra" a continuación Sobrenadantes de cultivo celular: Eliminar cualquier material particulado por centrifugación y analizar inmediatamente o almacenar las muestras a ≤ -20 °C. Evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. Suero: Usar un tubo separador de suero y dejar que las muestras coagulen durante 30 minutos, luego centrifugar durante 10 minutos a 1000 x g. Eliminar el suero y analizar inmediatamente o almacenar las muestras a ≤ -20 °C. Evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. Plasma: Recolectar plasma usando citrato, EDTA o heparina como anticoagulante. Centrifugar durante 10 minutos a 1000 x g dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección. Analizar inmediatamente o almacenar las muestras a ≤ -20 °C. Evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. Preparación y manejo de estándares 1. Reconstitución: Después de calentar el estándar liofilizado a temperatura ambiente, abrir cuidadosamente el vial para evitar la pérdida de material. Reconstituya el estándar liofilizado con 1,0 mL de agua desionizada para obtener un estándar madre. Deje que el estándar se equilibre durante al menos 15 minutos antes de realizar diluciones. Mezcle suavemente con vórtex. 2. Almacenamiento/manipulación del estándar reconstituido: Después de la reconstitución, alícuota inmediatamente el estándar madre en viales de polipropileno a 50 µL por vial y congélelo a -80 °C durante un máximo de 6 meses. Si es necesario, almacene a 2-8 °C durante un máximo de 8 horas antes de alícuotarlo/congelarlo. No deje el estándar reconstituido a temperatura ambiente. 3. Preparación de los estándares para el ensayo: a. Prepare un estándar de 4000 pg/mL a partir del estándar madre. Mezcle con vórtex. (Consulte las instrucciones de dilución en el Certificado de instrucciones/análisis). b. Añada 300 µL de diluyente de ensayo a 6 tubos. Etiquetar como 2000 pg/mL, 1000 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL y 62,5 pg/mL. c. Realizar diluciones seriadas añadiendo 300 µL de cada estándar al siguiente tubo y agitando con vórtex entre cada transferencia. El diluyente de ensayo sirve como estándar cero (0 pg/mL). Preparación de la muestra A. Tampón de lisis preparado: El cóctel de inhibidores de proteasa BD Pharmingen™ (n.º de cat. 554779) se presenta como polvo liofilizado. Antes de usar, añadir 1,0 mL de etanol puro para obtener un cóctel de inhibidores de proteasa 50X. Añadir el cóctel de inhibidores de proteasa reconstituido en una proporción 1:50 al tampón de lisis inmediatamente antes de usar. Siempre guarde el cóctel de inhibidores de proteasa reconstituido a ≤ -20 °CB Lisado celular: 1. Contar las células para determinar el número de células/ml 2. Centrifugar las células a 2500 g durante 5 min 3. Resuspender el pellet celular en tampón de lisis preparado y helado. Usar 1 ml de tampón de lisis por cada 4 x 10^6 células. Lisar las células en hielo durante 45 min. 4. Limpiar el lisado de los restos celulares centrifugando a 40 000 g durante 45 min 5. Recoger el sobrenadante transparente para su análisis. Procedimiento de ensayo recomendado 1. Cubrir los micropocillos con 100 µL por pocillo de anticuerpo de captura diluido en tampón de recubrimiento. Para la dilución de recubrimiento de anticuerpo recomendada, consultar las instrucciones/certificado de análisis específicos del lote. Sellar la placa e incubar durante la noche a 4 °C. 2. Aspirar los pocillos y lavar 3 veces con ≥ 300 µL/pocillo de tampón de lavado. Tras el último lavado, invierta la placa y seque con papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual. 3. Bloquee las placas con ≥ 200 µL/pocillo de diluyente de ensayo. Incube a TA durante 1 hora. 4. Aspire/lave como en el paso 2. 5. Prepare las diluciones del estándar y de la muestra en diluyente de ensayo. Consulte "Preparación y manipulación de estándares". 6. Pipetee 100 µL de cada estándar, muestra y control en los pocillos correspondientes. Selle la placa e incube durante 2 horas a TA. 7. Aspire/lave como en el paso 2, pero con un total de 5 lavados. 8. Añada 100 µL de detector de trabajo (anticuerpo de detección + reactivo SAv-HRP) a cada pocillo. Selle la placa e incube durante 1 hora a TA. 9. Aspire/lave como en el paso 2, pero con un total de 7 lavados. NOTA: En este paso de lavado final, sumerja los pocillos en tampón de lavado durante 30 segundos a 1 minuto para cada lavado. 10. Añada 100 µL de solución de sustrato a cada pocillo. Incube la placa (sin sellador de placa) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. 11. Añada 50 µL de solución de parada a cada pocillo. 12. Lea la absorbancia a 450 nm en los 30 minutos siguientes a la parada de la reacción. Si dispone de corrección de longitud de onda, reste la absorbancia a 570 nm de la absorbancia a 450 nm. Resumen del procedimiento de ensayo 1. Añada 100 µL de Capture Ab diluido a cada pocillo. Incube durante la noche a 4 °C 2. Aspire y lave 3 veces. 3. Bloquee las placas: 200 µL de diluyente de ensayo en cada pocillo. Incube 1 hora a temperatura ambiente 4. Aspire y lave 3 veces. 5. Añada 100 µL de estándar o muestra a cada pocillo. Incubar 2 h RT. 6. Aspirar y lavar 5 veces. 7. Añadir 100 µL de detector de trabajo (Detección Ab + SAv-HRP) a cada pocillo. Incubar 1 h RT 8. Aspirar y lavar 7 veces (con remojos de 30 segundos a 1 minuto) 9. Añadir 100 µL de solución de sustrato a cada pocillo. Incubar 30 min RT en oscuridad 10. Añadir 50 µL de solución de parada a cada pocillo. Leer a 450 nm en 30 min con corrección λ 570 nm. Cálculo de resultados Calcular la absorbancia media para cada conjunto de estándares, controles y muestras duplicados. Restar la absorbancia media del estándar cero de cada uno. Graficar la curva estándar en papel milimetrado logarítmico, con la concentración de TRAIL en el eje x y la absorbancia en el eje y. Dibujar la curva de mejor ajuste a través de los puntos estándar. Para determinar la concentración de TRAIL de las muestras desconocidas, calcule su valor medio de absorbancia en el eje Y y trace una línea horizontal hasta la curva estándar. En el punto de intersección, trace una línea vertical hasta el eje X y lea la concentración de TRAIL. Si las muestras se diluyeron, multiplique la concentración de TRAIL por el factor de dilución. También se puede emplear la reducción de datos computacional mediante un análisis de regresión logarítmica. Reactividad cruzada de especificidad: Los siguientes factores se analizaron en el ensayo BD OptEIA™ a ≥ 100 ng/mL y no se identificó reactividad cruzada. Humano recombinante: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, GM-CSF, IFN-γ, TNF, LT-α (TNF-β), TNFRI, TNFRII, IL-1sRI, IL-1sRII, sCD40, IL-4sR Limitaciones del procedimiento · Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. · No se ha investigado exhaustivamente la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. · Los sets BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes de sets. No se recomienda utilizar reactivos de otros fabricantes en este set.
Avisos del producto: Avisos del producto Para obtener capacitación en línea sobre las técnicas ELISA del conjunto BD OptEIA™, consulte http://www.bdbiosciences.com/OptEIA/downloads.shtml Las muestras que generen valores de absorbancia superiores a la curva estándar deben diluirse con diluyente estándar y volver a analizarse. No se ha investigado a fondo la interferencia de metabolitos de fármacos, receptores solubles u otras proteínas de unión en las muestras. No se puede excluir la posibilidad de interferencia. Los conjuntos BD OptEIA™ están diseñados para usarse como una unidad integral. No mezcle reactivos de diferentes lotes del conjunto. No se recomienda el uso de reactivos de otros fabricantes en este conjunto. Los reactivos que contienen conservantes pueden ser tóxicos si se ingieren, inhalan o entran en contacto con la piel. Manipule todas las muestras de suero y plasma de acuerdo con las directrices del NCCLS para prevenir la transmisión de infecciones transmitidas por la sangre. Precaución: La azida sódica produce ácido hidrazoico, altamente tóxico en condiciones ácidas. Diluya los compuestos de azida en agua corriente antes de desecharlos para evitar la acumulación de depósitos potencialmente explosivos en las tuberías. Todas las proteínas séricas provienen de mataderos inspeccionados por el USDA ubicados en Estados Unidos. ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company.
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